BD، 557630، BD™ ELISPOT HRP Streptavidin لـ ELISPOT

التطبيق: ELISPOT (يتم اختباره بشكل روتيني)
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ProClin™ 150 كمادة حافظة.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم ربط الستربتافيدين بالإنزيم في ظل ظروف مثالية. يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات الفحص الموصى بها: بروتوكول ELISPOT القياسي، المحاليل المنظمة، والوسط، والكواشف الأخرى لفحوصات ELISPOT، محلول التغطية: محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي (PBS): 8 غرام من كلوريد الصوديوم؛ 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم؛ 1.44 غرام من Na2HPO4•7H2O؛ 0.24 غرام من KH2PO4؛ يُضاف الماء المقطر إلى لتر واحد. يُضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2، ويُعقم بالبخار أو يُرشح تعقيمًا (بمسام 0.2 ميكرومتر) ويُخزن عند 4 درجات مئوية. وسط زراعة الأنسجة الكامل: يُستخدم عادةً وسط RPMI 1640 (Bio-Whittaker، رقم المنتج 12-167Q) أو أي وسط مناسب آخر يحتوي على 10% من مصل بقري جنيني مُعطَّل حراريًا، و1% من البنسلين-ستربتومايسين-إل-جلوتامين (Gibco-BRL، رقم المنتج 10378-016)، و5 × 10⁻⁵ مولار من 2-مركابتوإيثانول، لزراعة الخلايا البشرية، وخلايا الرئيسيات غير البشرية، وخلايا القوارض. محلول PBS-Tween®: محلول ملحي فوسفاتي يحتوي على 0.05% من Tween®-20 (Sigma، P-1379؛ 0.5 مل من Tween®-20 لكل لتر من محلول PBS). محلول التخفيف: محلول ملحي فوسفاتي يحتوي على 10% من مصل بقري جنيني. محلول الركيزة: استخدم مجموعة ركائز BD™ ELISPOT AEC (رقم المنتج 551951) من BD Biosciences لسهولة الاستخدام. البروتوكول 1. الجسم المضاد للطلاء: أ. خفف الجسم المضاد المُلتقط إلى التركيز الموصى به باستخدام محلول الطلاء. أضف 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر من صفيحة ELISPOT. ب. أعد غطاء صفيحة ELISPOT واحفظ الصفائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. 2. الحجب: أ. تخلص من الجسم المضاد للطلاء. اغسل الآبار مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر/بئر من وسط زراعة الأنسجة الكامل الذي يحتوي على 10% من مصل الأبقار الجنيني. ب. أضف 200 ميكرولتر/بئر من وسط زراعة الأنسجة الكامل؛ أعد غطاء صفيحة ELISPOT واتركها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 3. تنشيط الخلايا: تختلف بروتوكولات التنشيط المحددة، بما في ذلك تركيزات الخلايا وأوقات الحضانة، باختلاف نوع الخلية، ونوع المحفز، والمادة التحليلية المستهدفة. أ. تخلص من وسط زراعة الأنسجة الكامل. ب. حضّر عاملًا محفزًا للانقسام الخلوي، أو مستضدًا، أو أي عامل بيولوجي آخر مخفف في وسط زراعة الأنسجة الكامل لمعالجة الخلايا. أضف 100 ميكرولتر/بئر في صفيحة ELISPOT. ج. حضّر معلقات خلوية بكثافات مختلفة (على سبيل المثال، من 1 × 10⁵ خلية/مل إلى 2 × 10⁶ خلية/مل). لاحظ أنه يجب تحضير ضوابط سلبية مناسبة عن طريق إضافة الخلايا إلى الآبار بدون عامل معالجة معين، وإنشاء آبار خلفية بدون خلايا (أي آبار تحتوي فقط على وسط زراعة الأنسجة الكامل). يمكن إجراء معايرة الخلايا إما في صفيحة زراعة خلايا أخرى، أو في أنابيب ثم نقلها إلى الآبار الدقيقة في صفيحة ELISPOT، أو إجراؤها مباشرة في صفيحة ELISPOT. يجب الحرص على عدم لمس أو إتلاف سطح الآبار الدقيقة المطلي. يجب إضافة الخلايا بحجم 100 ميكرولتر إلى الآبار الدقيقة في صفيحة ELISPOT. د. بعد إضافة الخلايا، يُعاد غطاء صفيحة ELISPOT وتُحضن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون، ورطوبة 99%. تختلف مدة التحضين حسب العامل المستخدم لمعالجة الخلايا لتحفيز (أو عدم تحفيز) إفراز المادة المراد تحليلها (على سبيل المثال، عادةً ما تُزرع الخلايا لمدة تتراوح بين 2 و48 ساعة). 4. الأجسام المضادة للكشف: أ. تُسحب معلقات الخلايا المزروعة من الآبار الدقيقة في صفيحة ELISPOT. بعد الخطوة 3، لا يلزم اتباع ظروف التعقيم. تُغسل الآبار وتُنقع مرتين باستخدام 200 ميكرولتر/بئر من الماء المقطر (dH2O). تُترك الآبار منقوعة لمدة 3-4 دقائق في كل خطوة غسل. ب. تُغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول PBS-Tween® لكل بئر. يُتخلص من محلول الغسل. ج. خفف الأجسام المضادة للكشف المُؤشَّرة بالبيوتين في محلول التخفيف. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر. د. أعد غطاء صفيحة ELISPOT واحضنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 5. ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (ستربتأفيدين-HRP) [رقم المنتج 557630]: أ. تخلص من محلول الأجسام المضادة للكشف. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر/بئر من محلول PBS-Tween®. اترك الآبار منقوعة لمدة 1-2 دقيقة في كل خطوة غسل. ب. خفف ستربتأفيدين-HRP في محلول التخفيف. أضف 100 ميكرولتر من ستربتأفيدين-HRP المخفف لكل بئر. ج. أعد غطاء صفيحة ELISPOT؛ واحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 6. الركيزة: أ. تخلص من محلول ستربتأفيدين-HRP. أ. اغسل الآبار 4 مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول PBS-Tween® لكل بئر. اترك الآبار منقوعة لمدة 1-2 دقيقة في كل خطوة غسل. ب. اغسل الآبار وانقعها مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من محلول PBS لكل بئر. ج. أضف 100 ميكرولتر من محلول ركيزة AEC المُحضر باستخدام مجموعة ركائز BD™ ELISPOT AEC (رقم المنتج 551951) إلى كل بئر. راقب تطور البقعة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5-60 دقيقة. لا تدع اللون يتطور بشكل مفرط، فهذا سيؤدي إلى ارتفاع مستوى الخلفية. د. أوقف تفاعل الركيزة بشطف الآبار جيدًا بالماء المقطر. هـ. جفف الصفيحة بالهواء لمدة ساعتين أو طوال الليل في الظلام حتى تجف تمامًا. إزالة الصينية البلاستيكية أسفل صفيحة 96 بئرًا تُسهل عملية التجفيف. خزّن الصفيحة في كيس بلاستيكي محكم الإغلاق، في مكان مظلم، قبل التحليل. و. قم بحصر البقع البنية يدويًا عن طريق الفحص تحت مجهر تشريحي (أو عدسة مكبرة ثابتة) أو تلقائيًا باستخدام محلل ELISPOT وبرنامجه. تحذير: يحتوي ستربتأفيدين-HRP (المكون 51-9000209) على 0.004% من خليط CMIT/MIT (3:1)، وهو خليط من: 5-كلورو-2-ميثيل-4-أيزوثيازولين-3-ون [رقم EC 247-500-7] و2-ميثيل-4-أيزوثيازولين-3-ون [رقم EC 220-239-6] (3:1). بيانات المخاطر: قد يسبب رد فعل تحسسي جلدي. بيانات الاحتياطات: تجنب استنشاق الغبار/الأبخرة/الغازات/الرذاذ. ارتدِ قفازات/ملابس واقية/واقي للعينين/واقي للوجه. لا يُسمح بإخراج ملابس العمل الملوثة من مكان العمل. في حالة حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيبًا. في حالة ملامسة الجلد: اغسل بكمية وفيرة من الماء. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية.
إشعارات المنتج: يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. المكون الخطير: ProClin™ 150. تجنب ملامسة الجلد والعينين والابتلاع. اغسل الجلد المُعرَّض بالماء والصابون. اشطف العينين بالماء. يُرجى مراجعة http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS). ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas. للاطلاع على براءات الاختراع الأمريكية التي قد تنطبق، يُرجى زيارة bd.com/patents.