BD، 557982، زوج BD™ ELISPOT Mouse IL-10 ELISPOT

الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869114
الوصف: يُعدّ اختبار البقع المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISPOT) أداةً فعّالةً للكشف عن الخلايا الفردية التي تُفرز بروتينًا مُحددًا في المختبر، وحصر عددها. يعتمد اختبار ELISPOT على تقنية ELISA الساندويتشية، ويستمدّ دقّته وحساسيته من خلال استخدام أجسام مضادة عالية الألفة لالتقاط وكشف البروتينات، بالإضافة إلى تضخيم الإنزيم. على الرغم من أنه طُوّر في الأصل لتحليل الخلايا المُفرزة لأجسام مضادة مُحددة، فقد تمّ تكييف الاختبار لقياس ترددات الخلايا التي تُنتج وتُفرز جزيئات مُؤثرة أخرى، مثل السيتوكينات. تُتيح حساسية الاختبار قياس حتى الترددات المنخفضة جدًا للخلايا المُنتجة للسيتوكينات (على سبيل المثال، 1/300,000). تشمل نقاط القوة الفريدة لهذا الاختبار: الحساسية العالية، والإنتاجية العالية، وتحليل المحتوى العالي، والحد الأدنى من حجم المادة البيولوجية المطلوبة، وإمكانية تطبيقه على العينات البيولوجية المُجمدة/المُذابة، والتوافق مع الاختبارات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن نقل الخلايا التي تم تحليلها بتقنية ELISPOT لأغراض الاستنساخ، أو اختبارات التكاثر، أو قياس التدفق الخلوي، أو غيرها من طرق التحليل. يحتوي هذا المنتج على كمية كافية من الكواشف لخمس لوحات ذات 96 بئراً، بما في ذلك جسم مضاد غير موسوم لالتقاط السيتوكينات (بدون أزيد/بتركيز منخفض من السموم الداخلية)، وجسم مضاد للكشف عن السيتوكينات موسوم بالبيوتين، وشهادة تحليل توضح التركيزات المثلى للكواشف الخاصة بكل دفعة.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: إجراءات التحليل الموصى بها. المواد الكيميائية الإضافية المطلوبة: أ. يُوصى باستخدام BD™ ELISPOT Streptavidin Horseradish Peroxidase (رقم المنتج 557630). ب. محلول التغطية (محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات [PBS] بتركيز 1X): 8 غرام من كلوريد الصوديوم؛ 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم؛ 1.44 غرام من Na2HPO4·7H2O؛ 0.24 غرام من KH2PO4؛ مُذابة في الماء حتى يصل الحجم النهائي إلى لتر واحد. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2، ثم قم بالترشيح المعقم (مرشح بمسام بحجم 0.2 ميكرومتر) واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. ج. محلول الحجب: وسط زراعة الأنسجة الكامل (مثل RPMI 1640 يحتوي على 10% من مصل الأبقار الجنيني [FBS] و1% من البنسلين-ستربتومايسين-إل-جلوتامين [Gibco-BRL رقم 10378-016]). د. محلول الغسل الأول: محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1X يحتوي على 0.05% من توين-20 (0.5 مل من توين-20 لكل لتر من محلول الفوسفات الملحي). هـ. محلول الغسل الثاني: محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1X. و. محلول التخفيف: محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1X يحتوي على 10% من مصل الأبقار الجنيني. ز. يوصى باستخدام مجموعة ركائز BD™ ELISPOT AEC (رقم المنتج 551951). بدلاً من ذلك، يُمكن تحضيره كما يلي: 1. تحضير محلول AEC (3-أمينو-9-إيثيل-كاربازول؛ سيجما A-5754) المركز: امزج 100 ملغ من AEC في 10 مل من DMF (ثنائي ميثيل فورماميد؛ سيجما D-4551). تنبيه: يُسكب DMF في خزانة تهوية. يُحفظ المحلول في وعاء زجاجي. 2. تحضير محلول أسيتات 0.1 مولار: أضف 148 مل من حمض الأسيتيك/حمض الأسيتيك الجليدي 0.2 مولار إلى 352 مل من أسيتات الصوديوم 0.2 مولار. اضبط الحجم إلى 1 لتر من الماء المقطر؛ اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.0. 3. لتحضير محلول الركيزة النهائي، أضف 333.3 ميكرولتر من محلول AEC المركز إلى 10 مل من محلول أسيتات 0.1 مولار. قم بالترشيح باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر. أضف 5 ميكرولتر من H2O2 (30%) واستخدمه فورًا. ملاحظة حول بروتوكول ELISPOT: استخدم صفائح وكواشف ELISPOT في ظروف معقمة (مثل استخدام خزانة تدفق صفائحي أو خزانة السلامة البيولوجية) للخطوات من 1 إلى 7. المحاليل المشار إليها بعلامة النجمة (*) غير مشمولة وموصوفة في قسم الكواشف الإضافية المطلوبة. الأجسام المضادة للطلاء: 1. خفف الأجسام المضادة المُلتقطة في محلول الطلاء* (انظر شهادة التحليل لمعلومات تخفيف الأجسام المضادة). أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة المخفف إلى كل بئر من صفيحة ELISPOT؛ يُوصى باستخدام صفيحة Millipore، رقم المنتج S2EM004M99. 2. خزّن الصفائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل مع تغطيتها. الحجب: 3. تخلص من الأجسام المضادة للطلاء. اغسل الآبار مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر/بئر من محلول الحجب*. 4. أضف 200 ميكرولتر/بئر من محلول الحجب واحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تنشيط الخلايا 5. التخلص من محلول الحجب. تحضير الميتوجين أو المستضد، مخففًا في وسط زراعة الأنسجة الكامل (مثل RPMI 1640 مع مصل بقري جنيني، وبنسلين/ستربتومايسين، وغلوتامين). إضافة 100 ميكرولتر/بئر إلى صفيحة ELISPOT. 6. تحضير معلقات خلوية بكثافات مختلفة (مثل 1 × 10⁵ خلية/مل - 2 × 10⁶ خلية/مل). إضافة 100 ميكرولتر/بئر من كل معلق خلوي إلى آبار صفيحة ELISPOT. 7. إعادة غطاء صفيحة ELISPOT. حضانة صفيحة ELISPOT عند 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون، ورطوبة 99%. يمكن تغيير مدة الحضانة (مثل ساعتين إلى 24 ساعة) حسب طبيعة نظام زراعة الخلايا المحفز. تختلف ظروف التنشيط المحددة وأوقات الحضانة تبعًا لنوع الخلية، وحركية التفاعل، والسيتوكين المراد فحصه. يُرجى مراجعة شهادة التحليل المرفقة مع كل زوج من اختبارات ELISPOT للاطلاع على ظروف الفحص الخاصة بالضوابط الإيجابية المقترحة. ملاحظة: بعد الخطوة 7، لم تعد هناك حاجة إلى ظروف التعقيم. جسم مضاد للكشف 8. شفط معلق الخلايا. غسل الآبار مرتين بالماء منزوع الأيونات. اترك الآبار منقوعة لمدة 3-5 دقائق في كل خطوة غسل. 9. غسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر/بئر من محلول الغسل الأول*. التخلص من محلول الغسل. 10. تخفيف جسم مضاد الكشف في محلول التخفيف* (راجع شهادة التحليل لمعلومات تخفيف الجسم المضاد). إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر. 11. إعادة الغطاء وحضانته لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. الإنزيم 12. التخلص من محلول جسم مضاد الكشف. غسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر/بئر من محلول الغسل الأول*. ١٣. خفف ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (HRP)* في محلول التخفيف. (يوصى باستخدام BD™ ELISPOT ستربتأفيدين-HRP، رقم المنتج ٥٥٧٦٣٠). أضف ١٠٠ ميكرولتر/بئر من ستربتأفيدين-HRP المخفف. ١٤. أعد الغطاء؛ حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ١٥. تخلص من محلول ستربتأفيدين-HRP. اغسل الآبار ٤ مرات باستخدام ٢٠٠ ميكرولتر/بئر من محلول الغسل الأول*. ١٦. اغسل الآبار مرتين باستخدام ٢٠٠ ميكرولتر/بئر من محلول الغسل الثاني*. ١٧. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الركيزة النهائي (AEC)* إلى كل بئر. راقب تطور البقعة من ٥ إلى ٦٠ دقيقة. ١٨. أوقف تفاعل الركيزة بغسل الآبار بالماء المقطر. ١٩. اترك الطبق ليجف في الهواء لمدة ساعتين أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم، حتى يجف تمامًا. خزّن الطبق في مكان مظلم قبل التحليل. ٢٠. عدّ البقع يدويًا باستخدام مجهر تشريحي أو تلقائيًا باستخدام جهاز تحليل ELISPOT.
إشعارات المنتج: يرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر