BD، 558315، مجموعة BD OptEIA™ Human C5b-9 ELISA

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869153
الوصف: تحتوي مجموعة OptEIA™ لـ C5b-9 البشري على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لـ C5b-9 الطبيعي في المصل والبلازما وعينات بيولوجية أخرى. تُوفّر مواد كافية لتحضير ما يقارب 5 صفائح من 96 بئرًا، شريطة اتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموصى بها والمحددة في هذه العبوة. المعايرة: تتم معايرة هذا الفحص المناعي باستخدام مصل بشري مُنشّط بعامل سم الكوبرا النقي. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA تصميمًا مرنًا للفحص ليناسب احتياجات كل مختبر على حدة. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: الالتقاط، الكشف، معايرة الأجسام المضادة، وقت الحضانة، درجة حرارة الحضانة، تركيبة مخفف الفحص، درجة حموضة المحلول المنظم، القوة الأيونية، تركيز البروتين، نوع الركيزة، تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع).
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف التحليل، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية - كربونات الصوديوم 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ 7.13 غرام من بيكربونات الصوديوم، 1.59 غرام من كربونات الصوديوم؛ يُكمل الحجم إلى 1.0 لتر؛ درجة الحموضة إلى 9.5. يُحضّر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف التحليل - محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD OptEIA (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُنشَّط حراريًا). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم خلال 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول الغسل - محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات* مع 0.05% توين-20. يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم خلال 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 4. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يوصى باستخدام مجموعة كواشف ركيزة BD OptEIA TMB (رقم المنتج 555214). 5. محلول الإيقاف - 1 مولار H3PO4 أو 2 مولار H2SO4. المواد الإضافية المطلوبة: 1. يوصى باستخدام صفائح BD Falcon™ ELISA ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح دقيقة قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة بيانات آلية. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو غشاء بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. السائل الطافي لمزارع الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل، واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان. البلازما: اجمع البلازما باستخدام EDTA كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g خلال 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان. يمكن أيضًا استخدام السترات أو الهيبارين كمضاد للتخثر إذا لزم الأمر. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد تسخين المعيار المجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المحلول القياسي المجفف بالتجميد باستخدام كمية مناسبة من مخفف المعايرة للحصول على محلول قياسي مركز بتركيز 30 نانوغرام/مل. اترك المحلول القياسي حتى يصل إلى حالة التوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ الدوّامي. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: استخدم المحلول القياسي المُعاد تكوينه فورًا. استخدم قارورة واحدة من المحلول القياسي لكل صفيحة ذات 96 بئرًا. 3. تحضير المحاليل القياسية للمعايرة: أ. حضّر محلولًا قياسيًا مركزًا بتركيز 30 نانوغرام/مل كما هو موضح في الخطوة 1 (إعادة التكوين) أعلاه. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ الدوّامي. ب. أضف 300 ميكرولتر من مخفف المعايرة إلى 6 أنابيب. ضع عليها ملصقات توضح تركيزات 15 نانوغرام/مل، 7.5 نانوغرام/مل، 3.75 نانوغرام/مل، 1.875 نانوغرام/مل، 0.938 نانوغرام/مل، و0.469 نانوغرام/مل. تحضير الكاشف العامل: 1. حدد الحجم المطلوب للتجربة: 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. حدد كمية الأجسام المضادة للكاشف بتركيز 250X وكمية ستربتأفيدين-HRP بتركيز 250X لإضافتها إلى مزيج الكاشف العامل. 3. أضف الأحجام المناسبة من الأجسام المضادة للكاشف بتركيز 250X وستربتأفيدين-HRP بتركيز 250X إلى مخفف الفحص لتحضير الحجم المطلوب من الكاشف العامل. لا تخفف الأجسام المضادة للكاشف أكثر من اللازم لتجربتك. 4. أضف الكاشف العامل إلى كل بئر كما هو موضح في إجراء الفحص. ملاحظة: يجب تحضير الكاشف العامل في غضون 15 دقيقة قبل الاستخدام. إجراء الفحص بالتفصيل: 1. خفف الأجسام المضادة للالتقاط بنسبة 1:250 في محلول التغطية، وقم بتغطية الآبار الدقيقة بـ 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة لكل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. لا تخفف الأجسام المضادة للالتقاط أكثر من اللازم لتجربتك. ٢. اسحب المحلول من الآبار واغسلها ٣ مرات باستخدام ٣٠٠ ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة وجففها بورق ماص لإزالة أي محلول متبقٍ. ٣. أغلق الصفائح باستخدام ٢٠٠ ميكرولتر أو أكثر من مخفف المعايرة لكل بئر. حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ٤. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة ٢. ٥. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف المعايرة. راجع "تحضير المعايير والتعامل معها". تأكد من تسجيل تركيز المعيار المُعاد تكوينه لاستخدامه لاحقًا. ٦. ضع ١٠٠ ميكرولتر من كل معيار وعينة وعينة تحكم في الآبار المناسبة باستخدام ماصة. أغلق الصفيحة وحضّنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ٧. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة ٢، ولكن مع ٣ غسلات إجمالًا. ٨. أضف ١٠٠ ميكرولتر من كاشف العمل إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 9. اسحب المحلول واغسل الصفيحة كما في الخطوة 2، ولكن مع 7 غسلات إجمالاً. 10. أضف 100 ميكرولتر من محلول ركيزة TMB إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 11. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. 12. اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، فاطرح الامتصاص عند 570 نانومتر من الامتصاص عند 450 نانومتر. ملخص إجراء الفحص: 1. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. حضّنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. 2. اسحب المحلول واغسلها 3 مرات. 3. صفائح الحجب: أضف 200 ميكرولتر من مخفف الفحص إلى كل بئر. حضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 4. اسحب المحلول واغسلها 3 مرات. 5. أضف 100 ميكرولتر من المحلول القياسي أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 6. اسحب المحلول واغسله 3 مرات. 7. أضف 100 ميكرولتر من محلول الكاشف المخفف إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 8. اسحب المحلول واغسله 7 مرات. 9. أضف 100 ميكرولتر من محلول ركيزة TMB إلى كل بئر. حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 10. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة مع تصحيح الطول الموجي عند 570 نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل منها. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع تركيز C5b-9 على المحور السيني والامتصاص على المحور الصادي. ارسم منحنى أفضل مطابقة يمر بنقاط المعيار. لتحديد تركيز C5b-9 في العينات المجهولة، ابحث عن متوسط ​​قيمة الامتصاص للعينة على المحور الصادي، وارسم خطًا أفقيًا يصل إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا يصل إلى المحور السيني، واقرأ تركيز C5b-9. إذا كانت العينات مخففة، اضرب تركيز C5b-9 في معامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام تحليل الانحدار اللوغاريتمي (log-log) لتقليل البيانات باستخدام الحاسوب. الخصوصية والتفاعل المتبادل: تم اختبار العوامل التالية في اختبار BD OptEIA عند تركيز ≥ 5 ميكروغرام/مل، ولم يتم تحديد أي تفاعل متبادل (قيمة ≥ 470 بيكوغرام/مل): بروتينات C3، C4، C5، C6، C7، C8، وC9 البشرية الأصلية النقية. محددات الإجراء: يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مخفف المعايرة القياسي، ثم إعادة اختبارها. لم يتم التحقق بدقة من تداخل نواتج أيض الدواء، أو المستقبلات الذائبة، أو البروتينات الرابطة الأخرى في العينات. ولا يمكن استبعاد احتمال حدوث هذا التداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات NCCLS لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر