BD، 556419، BD Pharmingen™ FITC Annexin V

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2665412
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ FITC Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (Kd ~5 × 10⁻²) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط FITC Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين FITC Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام FITC Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز الاستماتة باستخدام جسم مضاد بشري لـ CD95 (FAS): يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام FITC Annexin V على خط خلوي بشري. المواد: 1. خط خلوي أو خلايا أولية يمكن تحفيزها بسهولة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري لـ Fas. تشمل الأمثلة خلايا ليمفوما Daudi (ATCC CCL-213) وخلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). من المهم ملاحظة أنه قد يكون هناك تباين كبير بين الخطوط الخلوية فيما يتعلق بمستوى الاستماتة التي يمكن تحفيزها من خلال مستقبل Fas. أيضًا، ليس بالضرورة أن تخضع جميع أنواع الخلايا التي تُعبِّر عن مستضد Fas للاستماتة بوساطة Fas. تُعد الخطوط الخلوية المذكورة أعلاه ضوابط إيجابية جيدة لأنها تُحفَّز بقوة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة لـ Fas. 2. الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري لـ CD95 (Fas)، المستنسخ DX2 (رقم المنتج 555670). 3. بروتين G المؤتلف (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج P4689). وجدنا أن إضافة بروتين G إلى وسط زراعة الأنسجة يُحسّن بشكل ملحوظ كفاءة مستنسخ DX2 في تحفيز الاستماتة الخلوية. 4. قوارير زراعة الأنسجة T25. 5. وسط IMDM أو RPMI 1640 مع 10% من مصل الأبقار الجنيني المُعطّل حراريًا (FBS)، و1% من الجلوتامين، و1% من المضادات الحيوية (بنسلين/ستربتومايسين؛ 100 وحدة/مل). يُشار إلى هذا الوسط المُدعّم ببساطة باسم "الوسط" فيما يلي. الإجراء: 1. حافظ على الخلايا في المزرعة، وغيّر الوسط قبل يوم واحد من تحفيز الاستماتة الخلوية. ٢. تحفيز الاستماتة: أضف ٠٫٥ - ٢ ميكروغرام/مل من الجسم المضاد لـ CD95 (مستنسخ DX2) و١-٢ ميكروغرام/مل من البروتين G إلى قارورة T25 تحتوي على وسط غذائي يحتوي على حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل. يجب أن تتكون الضوابط السلبية مما يلي: (أ) حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل مع الوسط الغذائي فقط (بدون جسم مضاد أحادي النسيلة أو بروتين G)، و(ب) حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل مع الوسط الغذائي و١ ميكروغرام/مل من البروتين G فقط (بدون جسم مضاد أحادي النسيلة). ٣. حضّن الخلايا لمدة ٢ إلى ١٢ ساعة عند ٣٧ درجة مئوية. ٤. تابع بروتوكول تلوين FITC Annexin V لقياس الاستماتة. يمكن أيضًا ملاحظة موت الخلايا المبرمج (الاستماتة) باستخدام المجهر الضوئي، أو الرحلان الكهربائي الهلامي (سلالم تجزئة الحمض النووي)، أو باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي القائم على تجزئة الحمض النووي، مثل مجموعة APO-BRDU™ (رقم المنتج 556405) أو مجموعة APO-DIRECT™ (رقم المنتج 556381). تحفيز الاستماتة باستخدام جسم مضاد للفأر CD95 (FAS): يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام FITC Annexin V على خلايا الفئران. المواد: 1. خط خلوي أو خلايا أولية يمكن تحفيزها بسهولة على الخضوع للاستماتة بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر Fas. يمكن استخدام الخلايا التيموسية المعزولة من فأر BALB/c بعمر 4-6 أسابيع. ٢. جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD95 (Fas) في الفئران، مستنسخ Jo2 (رقم المنتج 554254). ٣. بروتين G مُعاد التركيب (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج P4689). وجدنا أن إضافة بروتين G إلى وسط زراعة الأنسجة يُحسّن بشكل ملحوظ فعالية الجسم المضاد Jo2 في تحفيز الاستماتة الخلوية. ٤. قوارير زراعة الأنسجة T25. ٥. وسط RPMI-1640 مع ١٠٪ من مصل جنين البقر المُعطّل حراريًا (FBS)، و١٪ من الجلوتامين، و١٪ من المضادات الحيوية (بنسلين/ستربتومايسين؛ ١٠٠ وحدة/مل). يُشار إلى هذا الوسط المُدعّم ببساطة باسم "الوسط" فيما يلي. الإجراء: ١. عزل الخلايا التائية من غدة التيموس لفأر من سلالة BALB/c، عمره من ٤ إلى ٦ أسابيع. ٢. تحفيز الاستماتة الخلوية. أضف 2.5-10 ميكروغرام/مل من Jo2 (رقم المنتج 554254) و1-2 ميكروغرام/مل من البروتين G إلى قارورة T25 تحتوي على حوالي 2 × 10⁶ خلية تائية/مل. يجب أن تتكون الضوابط السلبية من: (أ) حوالي 2 × 10⁶ خلية تائية/مل مع وسط زراعي فقط (بدون أجسام مضادة أحادية النسيلة أو بروتين G)، (ب) حوالي 2 × 10⁶ خلية تائية/مل مع وسط زراعي و1-2 ميكروغرام/مل من البروتين G فقط (بدون أجسام مضادة أحادية النسيلة). 3. حضّن الخلايا لمدة 2-12 ساعة عند 37 درجة مئوية. 4. تابع بروتوكول تلوين FITC Annexin V لقياس موت الخلايا المبرمج. يمكن أيضًا ملاحظة موت الخلايا المبرمج (الاستماتة) باستخدام المجهر الضوئي، أو الرحلان الكهربائي الهلامي (سلالم تجزئة الحمض النووي)، أو باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي القائم على تجزئة الحمض النووي، مثل مجموعة APO-BRDU™ (رقم المنتج 556405) أو مجموعة APO-DIRECT™ (رقم المنتج 556381). يُستخدم بروتوكول تلوين FITC Annexin V لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تخضع للاستماتة بشكل كمي ضمن مجموعة من الخلايا. يعتمد هذا البروتوكول على خاصية فقدان الخلايا لتناظر غشائها في المراحل المبكرة من الاستماتة. في الخلايا المستميتة، ينتقل الفوسفوليبيد الغشائي فوسفاتيديل سيرين (PS) من الطبقة الداخلية للغشاء البلازمي إلى الطبقة الخارجية، مما يعرضه للبيئة الخارجية. بروتين Annexin V هو بروتين يرتبط بالفوسفوليبيدات ويعتمد على الكالسيوم، وله ألفة عالية للفوسفاتيديل سيرين (PS)، ويُستخدم لتحديد الخلايا الميتة التي تظهر فيها جزيئات PS مكشوفة. أما بروبيديوم يوديد (PI) فهو مسبار قياسي لقياس حيوية الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي، ويُستخدم للتمييز بين الخلايا الحية وغير الحية. فالخلايا الحية ذات الأغشية السليمة لا تسمح بمرور PI، بينما تكون أغشية الخلايا الميتة والتالفة نفاذة له. الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لبروتين Annexin V المرتبط بـ FITC وتلوينًا سلبيًا لـ PI تكون في طور الموت الخلوي المبرمج (الاستماتة). أما الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لكل من بروتين Annexin V المرتبط بـ FITC و PI فتكون إما في المرحلة النهائية من الاستماتة، أو في طور النخر، أو ميتة بالفعل. بينما الخلايا التي تُظهر تلوينًا سلبيًا لكل من بروتين Annexin V المرتبط بـ FITC و PI فتكون حية ولا تخضع لعملية استماتة قابلة للقياس. الكواشف: 1. بروتين Annexin V المرتبط بـ FITC: مُضمن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 2. بروبيديوم يوديد (PI): غير مُضمن. صبغة PI (رقم المنتج 556463) هي صبغة سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام لتلوين الأحماض النووية. استخدم ما يصل إلى 10 ميكرولتر لكل اختبار من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل. 3. محلول الربط 10×: غير مُضمّن. 0.1 مولار هيبس (الأس الهيدروجيني 7.4)، 1.4 مولار كلوريد الصوديوم، 25 ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء المنتج برقم المنتج 556454. التلوين: 1. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط 1× بتركيز 1 × 10⁶ خلية/مل. 2. انقل 100 ميكرولتر من المحلول (1 × 10⁵ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة 5 مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من أنيكسين V المُفلور. 4. أضف 10 ميكرولتر من صبغة PI. قد يختلف التركيز الأمثل لصبغة البروبيديوم أيوديد (PI) بين سلالات الخلايا، حيث يُرجح أن يكون 10 ميكرولتر من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل هو الحد الأقصى المطلوب. وقد يُعطي استخدام كمية أقل نتائج مثلى في بعض الأنظمة التجريبية. 5. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في الظلام. 6. أضف 400 ميكرولتر من محلول الربط المخفف (1×) إلى كل أنبوب. حلل النتائج باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: 1. خلايا غير مصبوغة. 2. خلايا مصبوغة بـ FITC Annexin V (بدون PI). 3. خلايا مصبوغة بـ PI (بدون FITC Annexin V). ضوابط التلوين الأخرى: ينبغي استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام FITC Annexin V و/أو FITC Annexin V و PI. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (FITC Annexin V إيجابي، PI سلبي أو FITC Annexin V إيجابي، PI إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا المستميتة والميتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي تم تحفيزها على الخضوع للاستماتة عن طريق طرح نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة غير المعالجة من نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة المعالجة. بما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للخلايا التي تخضع للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة سيكون لها غشاء تالف وستتصبغ بشكل إيجابي لكل من PI وFITC Annexin V. وبالتالي، فإن الفحص لا يميز بين الخلايا التي خضعت بالفعل لموت الخلايا المبرمج وتلك التي ماتت نتيجة لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستتصبغ الخلايا الميتة بكل من FITC Annexin V وPI.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.