BD، 559073، BD Pharmingen™، عنصر تحكم من نوع IgG2a κ نقي من الفئران

النمط المصلي: فأر LOU، المعروف أيضًا باسم Louvain، LOU/C، LOU/M IgG2a، κ
المستضد: الغلوبولين المناعي المجمع للفئران
التطبيق: التحكم في النمط المتماثل (يتم اختباره بشكل روتيني)، الكيمياء المناعية النسيجية - الفورمالين (يلزم استرجاع المستضد)، الكيمياء المناعية النسيجية - المجمد، الكيمياء المناعية النسيجية - المثبت بالزنك (يتم اختباره أثناء التطوير)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_479682
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب. يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
إجراءات الفحص الموصى بها: الفحص المناعي الخلوي: يُعدّ الجسم المضاد R35-95 النقي (رقم المنتج 559073) في صيغة الفحص المناعي الخلوي (ICC) عنصر تحكم من نوع الغلوبولين المناعي IgG2a للفئران، ويمكن استخدامه للمساعدة في تحديد مستوى التلوين الخلفي غير النوعي في فحص مناعي خلوي غير مباشر للسيتوكينات. يجب استخدام الجسم المضاد R35-95 النقي بنفس تركيز الجسم المضاد النوعي الأولي، وتصويره في ظل نفس الظروف من خلال إجراء تلوين من ثلاث خطوات بالاشتراك مع الجسم المضاد IgG المضاد للفئران من الماعز والمُعلّم بالبيوتين (رقم المنتج 559286) وستربتافيدين-بيروكسيداز الفجل. تجدون أدناه بروتوكولًا مفصلًا لإجراء الفحص المناعي الخلوي للسيتوكينات. بروتوكول الكيمياء المناعية الخلوية للسيتوكينات - الكواشف المطلوبة: 1. محلول التثبيت: يُذاب 5% فورمالين (أو 10% فورمالين، CMS، رقم المنتج 245-684) في محلول ملحي مُخفف بالفوسفات (PBS) (محلول Bacto FA، مختبرات Difco، رقم المنتج 2314-15-0) أو محلول تثبيت BD Pharmingen™ ICC (رقم المنتج 550010). 2. محلول حجب البيروكسيداز الداخلي: كاشف حجب البيروكسيداز DAKO (DAKO، رقم المنتج S2001). 3. محلول حجب البيوتين الداخلي: مجموعة حجب البيوتين/أفيدين (مختبرات Vector، رقم المنتج SP-2001). 4. محلول تخفيف الأجسام المضادة: مُخفف الأجسام المضادة BD Pharmingen للكيمياء المناعية الخلوية، رقم المنتج 1000. رقم 559148، مُدعّم بالصابونين 5. شرائح مجهرية: شرائح لاصقة (شركة إيري ساينتيفيك، رقم المنتج ER-202B-AD) أو شرائح كولورفروست/بلس (فيشر، رقم المنتج 12-550-17) للتحضير الخلوي. 6. جسم مضاد للخطوة الثانية: بيوتين ماعز مضاد لـ IgG الفئران (رقم المنتج 559286). 7. نظام الكشف: BD™ Pharmingen ستربتأفيدين بيروكسيداز الفجل (HRP) رقم المنتج 550946. 8. مجموعة ركائز BD Pharmingen™ DAB (تحتوي على رباعي هيدروكلوريد ثنائي أمينوبنزيدين)، رقم المنتج 550880. 9. وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل: أكوا-ماونت (مختبرات ليرنر، رقم المنتج 13800). إجراء التلوين المناعي الخلوي لتحضيرات الخلايا المفردة: يصف هذا الإجراء تقنية التلوين المناعي الإنزيمي للسيتوكينات داخل الخلايا المفردة المثبتة على شرائح مجهرية عن طريق الالتصاق (الشرائح اللاصقة) أو الطرد المركزي (أجهزة الطرد المركزي الخلوي). الشرائح اللاصقة: 1. تُجمع الخلايا وتُغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) باستخدام جهاز الطرد المركزي (400 × جم لمدة 5 دقائق) لإزالة البروتين المتبقي. 2. يُضبط تركيز الخلايا عند 4-5 × 10^6 خلية/مل في محلول الفوسفات الملحي (PBS). 3. يُوضع 20 ميكرولتر من معلق الخلايا في كل بئر من آبار الشرائح اللاصقة وتُترك لتلتصق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. يُرجى ملاحظة أنه يجب غسل الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل نقل الخلايا. 4. تُثبت الخلايا على الشرائح باستخدام محلول التثبيت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٥. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٦. حضّن الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) المُضاف إليه ١٪ (وزن/حجم) من ألبومين المصل البقري (BSA) (سيجما، رقم المنتج A43-78) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو ١٠ دقائق عند ٣٧ درجة مئوية. ٧. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) ثم تابع عملية التلوين أو جففها بالهواء واحفظها عند -٨٠ درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا. ٨. حضّن الشرائح مع ٢٠ ميكرولتر من مصل الماعز بتركيز ١٪ ومحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع ٠.١٪ (وزن/حجم) من الصابونين لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٩. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٠. عطّل نشاط البيروكسيداز الداخلي باستخدام محلول تثبيط البيروكسيداز الداخلي (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ١١. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٢. حضّن كل بئر مع أفيدين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. ١٣. اغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٤. حضّن كل بئر مع بيوتين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. ١٥. اغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٦. حضّن كل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع ٢٠ ميكرولتر من جسم مضاد نوعي للسيتوكين نقي أو جسم مضاد من نوع الغلوبولين المناعي المناسب كعنصر تحكم، مخفف في محلول تخفيف التلوين المناعي النسيجي (IHC) من فارمينجن والمُضاف إليه الصابونين. ١٧. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٨. حضّن كل بئر مع ٢٠ ميكرولتر من جسم مضاد ثانوي مُبيوتيني مخفف في محلول تخفيف التلوين المناعي النسيجي (IHC) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١٩. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٢٠. ضع ٢٠ ميكرولتر من ستربتأفيدين-HRP (رقم المنتج ٥٥٠٩٤٦ من شركة BD) في كل بئر على الشرائح واحضنها لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٢١. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٢٢. حضّن الشرائح مع ركيزة DAB وفقًا لتعليمات النشرة الداخلية للمنتج لمدة تقل عن ٥ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ٢٣. أوقف تفاعل اللون بالغسل بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). ٢٤. تُثبّت الشرائح بعد ذلك في وسط التكتل للتخزين قصير الأجل. أجهزة الطرد المركزي الخلوي (CYTOSPINS): ١. جهّز حجرة عينة جهاز الطرد المركزي الخلوي (مثل Cytospin 3، Shandon، المملكة المتحدة أو جهاز طرد مركزي مماثل)، وبطاقة الترشيح، والشرائح، وحوامل جهاز الطرد المركزي الخلوي وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة. ٢. ضع ٤٠ ميكرولتر من حوالي ١ × ١٠^٦ خلية في كل حجرة عينة. 3. قم بتدوير الشرائح بسرعة 600 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. 4. أخرج الشرائح من حامل جهاز الطرد المركزي وضعها على حامل التلوين. 5. لتثبيت الخلايا وتلوينها، يرجى اتباع الخطوات من 4 إلى 24 المذكورة أعلاه لتلوين الخلايا على شرائح الالتصاق.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.