BD، 550007، BD Pharmingen™ مضاد الفأر النقي المضاد للإنترلوكين-1 بيتا البشري

الاسم البديل: IL-1 بيتا؛ إيل-1بيتا؛ إيل-1β؛ إيل1ب؛ إنترلوكين-1 بيتا
التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المصلي: IgG1، κ للفأر BALB/c
المستضد: إنترلوكين-1 بيتا البشري
التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)، الكيمياء المناعية الخلوية، التحييد (يتم اختباره أثناء التطوير)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_2124482
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب.
إجراءات الفحص الموصى بها: الفحص المناعي الخلوي: يمكن استخدام الشكل النقي من الجسم المضاد AS10 (رقم المنتج 550007) لتحديد وحصر الخلايا البشرية المنتجة للإنترلوكين-1β باستخدام الفحص المناعي الخلوي. وللحصول على أفضل تلوين مناعي خلوي غير مباشر، يجب معايرة الجسم المضاد AS10 (≤ 1 ميكروغرام) وتصويره من خلال إجراء تلوين من ثلاث خطوات باستخدام البيوتين، والأجسام المضادة IgG المضادة للفأر، والستربتافيدين المرتبط بإنزيم بيروكسيداز الفجل، وركيزة DAB. يرجى مراجعة البروتوكول للاطلاع على وصف مفصل لإجراء الفحص المناعي الخلوي. وللكشف الأمثل عن الخلايا المنتجة للسيتوكينات، توصي شركة فارمينجن باستخدام إنزيم بيروكسيداز الفجل كنظام إنزيمي مفضل. بروتوكول الكيمياء المناعية الخلوية للسيتوكينات - الكواشف المطلوبة: 1. محلول التثبيت: يُذاب 5% فورمالين (أو 10% فورمالين، CMS، رقم المنتج 245-684) في محلول ملحي مُخفف بالفوسفات (PBS) (محلول Bacto FA، مختبرات Difco، رقم المنتج 2314-15-0)، أو محلول تثبيت BD Pharmingen™ ICC (BD، رقم المنتج 550010). 2. محلول حجب البيروكسيداز الداخلي: كاشف حجب البيروكسيداز DAKO (DAKO، رقم المنتج S2001). 3. محلول حجب البيوتين الداخلي: مجموعة حجب البيوتين/أفيدين (مختبرات Vector، رقم المنتج SP-2001). ٤. محلول تخفيف الأجسام المضادة: محلول تخفيف الأجسام المضادة BD™ Pharmingen للتلوين المناعي النسيجي (رقم المنتج ٥٥٩١٤٨) مُدعّم بالصابونين. ٥. شرائح مجهرية: شرائح لاصقة (شركة إيري ساينتيفيك، رقم المنتج ER-٢٠٢B-AD) أو شرائح Colorfrost /Plus (شركة فيشر، رقم المنتج ١٢-٥٥٠-١٧) للتحضير الخلوي. ٦. جسم مضاد IgG مضاد للفأر مُرتبط بالبيوتين (رقم المنتج ٥٥٠٣٣٧) أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة Ig للفأر باستخدام إنزيم بيروكسيداز الفجل (رقم المنتج ٥٥١٠١١). ٧. نظام الكشف: نظام BD Pharmingen ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (HRP) (رقم المنتج ٥٥٠٩٤٦) أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة Ig للفأر باستخدام إنزيم بيروكسيداز الفجل (رقم المنتج ٥٥١٠١١). ٨. وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل: Aqua-mount® (مختبرات ليرنر، رقم المنتج ١٣٨٠٠). ٩. مجموعة ركيزة DAB (تحتوي على ٣،٣-ثنائي أمينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد)، (BD رقم المنتج ٥٥٠٨٨٠) أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة للفأر Ig HRP (رقم المنتج ٥٥١٠١١). إجراء التلوين المناعي الخلوي لتحضيرات الخلايا المفردة: يصف هذا الإجراء تقنية التلوين المناعي الإنزيمي للسيتوكينات داخل الخلايا المفردة المثبتة على شرائح مجهرية عن طريق الالتصاق (شرائح لاصقة) أو الطرد المركزي (شرائح سيتوسبين). الشرائح اللاصقة: ١. تُجمع الخلايا وتُغسل مرتين في محلول ملحي فوسفاتي باستخدام الطرد المركزي (٤٠٠ × جم لمدة ٥ دقائق) لإزالة البروتين المتبقي. ٢. اضبط تركيز الخلايا إلى ٤-٥ × ١٠⁶ خلية/مل في محلول الفوسفات الملحي (PBS). ٣. ضع ٢٠ ميكرولتر من معلق الخلايا في كل بئر من شرائح الالتصاق، واتركها تلتصق في درجة حرارة الغرفة لمدة ٢٠ دقيقة. يُرجى ملاحظة أنه يجب غسل الشرائح في محلول الفوسفات الملحي (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة ٥ دقائق قبل نقل الخلايا. ٤. ثبّت الخلايا على الشرائح باستخدام محلول التثبيت لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٥. اغسل الشرائح مرتين في محلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٦. احجب الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) المُضاف إليه ١٪ (وزن/حجم) من ألبومين المصل البقري (BSA) (من شركة سيجما) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو ١٠ دقائق عند ٣٧ درجة مئوية. ٧. اغسل الشرائح مرتين في محلول الفوسفات الملحي (PBS) ثم تابع عملية التلوين، أو جففها بالهواء واحفظها عند -٨٠ درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا. ٨. حضّن الشرائح مع ٢٠ ميكرولتر من مصل الماعز بتركيز ١٪ ومحلول فوسفات ملحي (PBS) مع ٠٫١٪ (وزن/حجم) من الصابونين لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٩. اغسل الشرائح مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٠. احجب نشاط البيروكسيداز الداخلي باستخدام محلول حجب البيروكسيداز الداخلي (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ١١. اغسل مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٢. حضّن كل بئر مع الأفيدين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. ١٣. اغسل مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٤. حضّن كل بئر مع البيوتين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. ١٥. اغسل مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٦. حضّن كل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع ٢٠ ميكرولتر من الأجسام المضادة النقية الخاصة بالسيتوكين أو نظير الغلوبولين المناعي المناسب كعنصر تحكم، مخففًا في محلول تخفيف IHC من Pharmingen والمُضاف إليه الصابونين. ١٧. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٨. حضّن كل بئر مع ٢٠ ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المُؤشَّرة بالبيوتين والمخففة في محلول تخفيف السيتوكين IHC لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١٩. اغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٢٠. ضع ٢٠ ميكرولتر من ستربتأفيدين-HRP (رقم المنتج ٥٥٠٩٤٦ من BD) على كل بئر في الشرائح، وحضّن لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٢١. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٢٢. حضّن الشرائح مع ركيزة DAB وفقًا للتعليمات (BD Cat. No. 550880) لمدة تقل عن ٥ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ٢٣. أوقف تفاعل اللون بالغسل بمحلول PBS. ٢٤. تُثبّت الشرائح بعد ذلك في وسط التكتل للتخزين قصير الأجل. أجهزة الطرد المركزي CYTOSPINS: ١. جهّز حجرة عينة جهاز الطرد المركزي Cytospin (مثل Cytospin 3، Shandon، المملكة المتحدة أو جهاز طرد مركزي مماثل)، وبطاقة الترشيح، والشرائح، وحامل جهاز الطرد المركزي Cytospin وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة. ٢. ضع ٤٠ ميكرولتر من حوالي ١ × ١٠⁶ خلية في كل حجرة عينة. ٣. قم بتدوير الشرائح بسرعة ٦٠٠ دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. ٤. أخرج الشرائح من حامل جهاز الطرد المركزي Cytospin وضعها على حامل التلوين. ٥. للتثبيت والتلوين، يُرجى اتباع الخطوات من ٤ إلى ٢٤ المذكورة أعلاه لتلوين الخلايا على شرائح الالتصاق.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يجب استخدام عنصر تحكم متماثل النمط بنفس تركيز الجسم المضاد المطلوب. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. أزيد الصوديوم مثبط عكسي لعملية الأيض التأكسدي؛ لذلك، يجب عدم استخدام مستحضرات الأجسام المضادة التي تحتوي على هذه المادة الحافظة في مزارع الخلايا أو حقنها في الحيوانات. يمكن إزالة أزيد الصوديوم عن طريق غسل الخلايا المصبوغة أو الجسم المضاد المرتبط بالصفيحة أو عن طريق غسيل الجسم المضاد القابل للذوبان في محلول منظم خالٍ من أزيد الصوديوم. نظرًا لأن السموم الداخلية قد تؤثر أيضًا على نتائج الدراسات الوظيفية، فإننا نوصي باستخدام صيغة الجسم المضاد NA/LE (خالية من الأزيد/منخفضة السموم الداخلية)، إن وجدت، للاستخدام في المختبر وفي الجسم الحي. يرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.