BD، 550474، BD Pharmingen™ APC Annexin V

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2868885
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ APC Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (Kd ~5 × 10⁻²) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط APC Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين APC Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام APC Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام APC Annexin V على خط خلوي (Jurkat). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (Sigma-Aldrich Cat.No. C-9911): 1 ملي مولار في DMSO. 2. خلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10⁶ خلية Jurkat. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتباع بروتوكول تلوين APC Annexin V لقياس موت الخلايا المبرمج. بروتوكول تلوين APC Annexin V: الكواشف: 1. APC Annexin V: مُضمَّن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. ٢. ٧-أمينو-أكتينوميسين د (٧-AAD): غير مُضمّن. ٧-AAD (رقم المنتج ٥٥٩٩٢٥) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم ٥ ميكرولتر لكل اختبار. ٣. محلول الربط ١٠X: غير مُضمّن. ٠.١ مولار هيبس (الأس الهيدروجيني ٧.٤)، ١.٤ مولار كلوريد الصوديوم، ٢٥ ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة ٤ درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء المنتج برقم المنتج ٥٥٦٤٥٤. التلوين: ١. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط ١X بتركيز ١ × ١٠⁶ خلية/مل. ٢. انقل ١٠٠ ميكرولتر من المحلول (١ × ١٠⁵ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة ٥ مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من APC Annexin V (لتحليل اللون الواحد واللونين) و5 ميكرولتر من 7-AAD (لتحليل اللونين فقط). 4. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في الظلام. 5. أضف 400 ميكرولتر من محلول الربط 1X إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: 1. خلايا غير مصبوغة. 2. خلايا مصبوغة بـ APC Annexin V فقط (بدون 7-AAD). 3. خلايا مصبوغة بـ 7-AAD فقط (بدون APC Annexin V). ضوابط التلوين الأخرى: ينبغي استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام APC Annexin V و/أو APC Annexin V و7-AAD. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (APC Annexin V إيجابي، 7-AAD سلبي أو APC Annexin V إيجابي، 7-AAD إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا المستميتة والميتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي تم تحفيزها على الخضوع للاستماتة عن طريق طرح نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة غير المعالجة من نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة المعالجة. بما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للخلايا التي تخضع للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة سيكون لها غشاء تالف وستصبغ بشكل إيجابي لـ 7-AAD وكذلك لـ APC Annexin V. وبالتالي، فإن الفحص لا يميز بين الخلايا التي خضعت بالفعل لموت الخلايا المبرمج وتلك التي ماتت نتيجة لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستصبغ الخلايا الميتة بكل من APC Annexin V و 7-AAD.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. يمكن استخدام هذا الكاشف المقترن بـ APC في أي جهاز قياس تدفق خلوي مزود بليزر صبغي أو ليزر هيليوم-نيون أو ليزر ثنائي أحمر. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى مراجعة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors.