BD، 550750، BD™ DimerX DimerX I: بروتين اندماجي ثنائي قابل للذوبان معاد التركيب من الفأر H-2K[b]:Ig

النمط المصلي: IgG1 الفأري، λ
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_2868900
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم التعبير عن بروتين H-2K[b] مع بروتين β2M البشري في سلالة خلايا ورم البلازما الفأري J558L (ATCC TIB-6). ترتبط سلاسل عديد الببتيد H-2K[b] وβ2 بروابط غير تساهمية نتيجةً للتعبير المشترك عنهما داخل خلايا J558L. تم تنقية بروتين الاندماج H-2K[b]:Ig من سائل مزرعة الأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم التأكد من نقاء المستحضر بواسطة SDS-PAGE.
إجراءات الفحص الموصى بها: تم اختبار بروتين الاندماج H-2K[b]:Ig هذا باستخدام التلوين المناعي الفلوري (≤ 4 ميكروغرام H-2K[b]:Ig/مليون خلية) (انظر الشكل) وتحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية النوعية للمستضد لضمان النوعية والتفاعل. من الضروري تحميل أجزاء H-2K[b] من البروتين الثنائي بببتيد ذي صلة قبل التلوين المناعي الفلوري للخلايا التائية. يتم تحميل معقدات H-2K[b]:Ig بفعالية عن طريق الحضانة مع فائض من الببتيدات ذات الصلة (النوعية) أو غير ذات الصلة (الضابطة) (انظر البروتوكول 1). يمكن استخدام H-2Kb:Ig المحمل بالببتيد للتلوين المناعي الفلوري (انظر البروتوكول 2). نظرًا لاختلاف التطبيقات، يجب على كل باحث تحديد التخفيفات المناسبة للاستخدام الفردي. البروتوكول 1: تحميل الببتيد على البروتين الثنائي H-2K[b]:Ig. يُعد مستنسخ الخلايا التائية 2C، وهو مستنسخ متفاعل مع المستضدات الغريبة، متخصصًا في ببتيد داخلي المنشأ يُدعى p2Ca. وقد تم تحديد العديد من الببتيدات ذات الصلة أو نظائرها. تختلف هذه الببتيدات في تقييدها بواسطة معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) وفي ألفة ارتباطها بمستقبلات الخلايا التائية 2C (TCR). بالنسبة لـ H-2Kb، يمكن أيضًا التعرف على ببتيد SIY بواسطة مستقبلات الخلايا التائية 2C في سياق H-2K[b]. يتمتع SIY بألفة عالية نسبيًا لـ H-2K[b]، ويُقترح استخدامه كعنصر تحكم إيجابي لتلوين خلايا 2C في هذا الاختبار. تم اشتقاق مستنسخ 2C في الأصل عن طريق تحفيز خلايا طحال فئران BALB/c بخلايا P815 (H-2Ld) المُشععة. وقد وُصفت العديد من بروتوكولات تحميل الببتيد. تعتمد الطريقة المستخدمة في شركة BD Biosciences Pharmingen على التحميل السلبي للببتيد الزائد في المحلول مع بروتين H-2K[b]:Ig. وقد وجدنا أن التحميل السلبي فعالٌ للغاية، خاصةً مع الببتيدات ذات الألفة العالية. أما بالنسبة للببتيدات ذات الألفة المنخفضة، فقد يؤدي رفع النسبة المولية للببتيد إلى H-2K[b]:Ig إلى تحسين التحميل، كما تم تحديده بواسطة تحليل التدفق الخلوي. يُقترح أن يقوم الباحث، لكل ببتيد، بتحديد معايير مثل جرعة H-2K[b]:Ig لكل مليون خلية، والنسبة المولية للببتيد إلى H-2K[b]:Ig، ووقت تحميل الببتيد تجريبيًا. مع أن منتج BD DimerX هذا يحتوي على β2 ميكروغلوبولين، فإننا نوصي الباحثين الذين يحتاجون إلى كمية زائدة من β2 ميكروغلوبولين البشري المؤتلف، باستخدام منتج BD Biosciences Cat. رقم 551089. تحضير الببتيد وتحميله: 1. يجب تحديد الوزن الجزيئي (MW) للببتيد المطلوب. يمكن تقدير الوزن الجزيئي للببتيد بضرب عدد الأحماض الأمينية (AA) فيه (n) في 130 دالتون (d) لكل حمض أميني: الوزن الجزيئي للببتيد (d) = n (AA) × 130 (d/AA). 2. يمكن تحضير محلول أساسي من الببتيد بتركيز 20 ملغم/مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يُخفف محلول الببتيد إلى 2 ملغم/مل في محلول DPBS معقم، بدرجة حموضة 7.2، لاستخدامه في بروتوكول تحميل H-2K[b]:Ig. 3. يُخلط بروتين H-2K[b]:Ig مع الببتيد المحدد أو ببتيد التحكم بزيادة مولية قدرها 40 أو 160 أو 640 مولار (M). يمكن استخدام الحساب التالي، باستخدام ببتيد مكون من 8 أحماض أمينية (8mer) كمثال: Dp = الوزن الجزيئي للببتيد: على سبيل المثال، 8 أحماض أمينية × 130 = 1040 دالتون. DK[b] = الوزن الجزيئي لـ H-2K[b]:Ig = 250000 دالتون. R = النسبة المولية الزائدة المطلوبة، على سبيل المثال، 160. Mp = ميكروغرام (ميكروغرام) من الببتيد المطلوب. MK[b] = ميكروغرام (ميكروغرام) من H-2K[b]:Ig في التفاعل. تتراوح الكمية النموذجية من H-2K[b]:Ig المحمل بالببتيد والمستخدمة في تلوين قياس التدفق الخلوي بين 0.25 و 4 ميكروغرام لكل مليون خلية (اختبار). Mp = MK[b] x R x Dp = 4 ميكروغرام × 160 × 1040 d = 2.66 ميكروغرام. لذلك، يُضاف 2.66 ميكروغرام من الببتيد و4 ميكروغرام من H-2K[b]:Ig DKb 250,000 d إلى المحلول للحصول على التحميل الأمثل للببتيد على H-2Kb:Ig. 4. يُخلط الببتيد وH-2K[b]:Ig معًا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بدرجة حموضة 7.2، ويُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية طوال الليل. يمكن تخزين H-2K[b]:Ig المحمل بالببتيد عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. البروتوكول 2: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري 1. تحضير مزيج تلوين بروتين H-2K[b] المحمل بالببتيد عن طريق مزج 0.25-4 ميكروغرام من بروتين H-2K[b] المحمل بالببتيد لكل عينة مع 0.25-4 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج 550083) لكل عينة بنسبة 1:1 أو 1:2 من ثنائي الوحدات: الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1. حضن المزيج لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. 2. إضافة 0.25-4 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A111-3 النقي من نوع IgG1 للفأر (رقم المنتج 553485) لكل عينة إلى مزيج التلوين (انظر الخطوة 1 أعلاه). حضّن مزيج التلوين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. 3. أعد تعليق خلايا الفأر في محلول التلوين BD FACS™ [مثل DPBS، 1% FCS، 0.09% NaN3 أو محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS)، رقم المنتج 554656]، الذي يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد أحادي النسيلة BD Fc Block™ المضاد للفأر CD16/CD32 2.4G2 (رقم المنتج 553141/553142)، بتركيز 10⁶ خلية تقريبًا لكل 50 ميكرولتر. حضّن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™، رقم المنتج 352008). ٤. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول BD FACS الذي يحتوي على الكمية المثلى من مزيج التلوين لكل اختبار، بالإضافة إلى أي أجسام مضادة أخرى خاصة بعلامات سطح الخلية لاستخدامها مع كل عينة. ٥. اغسل الخلايا مرتين باستخدام ٢ مل من محلول BD FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × جم، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي ٠.٥ مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي. البروتوكول ٣: بديل: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري ١. أعد تعليق خلايا الفأر في محلول تلوين BD FACS [مثل DPBS، ١٪ FCS، ٠.٠٩٪ NaN3 أو محلول تلوين BD Pharmingen (FBS)، رقم المنتج]. [رقم 554656]، يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد أحادي النسيلة 2.4G2 المضاد للفأر CD16/CD32 والمُنقّى بتقنية Fc Block (رقم المنتج 553141/553142)، بتركيز 10⁶ خلية لكل 50 ميكرولتر. حضّن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon رقم المنتج 352008). 2. أضف 0.25 - 4 ميكروغرام من بروتين H-2K[b]:Ig المحمّل بالببتيد إلى معلق الخلايا. حضّن لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. 3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول BD FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 ميكروغرام، واسحب السائل الطافي. ٤. أعد تعليق الخلايا في ١٠٠ ميكرولتر من محلول BD FACS المحتوي على كاشف فلوري ثانوي مخفف بشكل مناسب. نستخدم عادةً الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج ٥٥٠٠٨٣). حضّن لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة عند ٤ درجات مئوية. ٥. اغسل الخلايا مرتين باستخدام ٢ مل من محلول BD FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × g، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي ٠.٥ مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.