BD، 550946، BD Pharmingen™ ستربتأفيدين HRP

التطبيق: الكيمياء المناعية النسيجية (يتم اختبارها بشكل روتيني)
RRID: AB_2868972
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ProClin™ 150 كمادة حافظة.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم ربط الستربتافيدين بالإنزيم في ظل ظروف مثالية. يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات الفحص الموصى بها: إجراءات الفحص الموصى بها: التحضير والتلوين المناعي النسيجي للشرائح المجمدة. المواد المطلوبة: محلول ملحي فوسفاتي (PBS)؛ 2-ميثيل بيوتان (أيزوبنتان)؛ أسيتون؛ نيتروجين سائل؛ ثلج جاف؛ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)؛ كحولات متدرجة التركيز؛ زيلين؛ هيماتوكسيلين. قوالب التضمين Peel-A-Way® (شركة Polysciences Inc.، وارينغتون، بنسلفانيا). مركب OCT لتجميد الأنسجة ومادة التضمين (Tissue-Tek®؛ شركة Sakura Finetek USA). أولاً: تثبيت الأنسجة ومعالجتها وتقطيعها للشرائح المجمدة. 1. ضع علامة على قالب التضمين واملأه جزئيًا بمادة تجميد الأنسجة والتضمين. 2. ضع عينة نسيج طازجة في قوالب التضمين المُعَلَّمة مسبقًا. 3. اغمر قالب التضمين مع النسيج في 2-ميثيل بيوتان مبرد مسبقًا في وعاء ديوار مملوء بالنيتروجين السائل حتى يكاد القالب يتجمد (30 ثانية). ملاحظة: إذا تُرك القالب لفترة أطول من اللازم، فقد يتشقق. 4. أخرج قالب النسيج من 2-ميثيل بيوتان باستخدام ملقط طويل. 5. ضع الأنسجة المضمنة على الثلج الجاف. (يمكن تخزين الأنسجة في قوالب التضمين). 6. خزّن قوالب الأنسجة المجمدة في مجمد بدرجة حرارة -70 درجة مئوية حتى تقطيعها. 7. للتقطيع، ثبّت قالب النسيج المجمد على حامل جهاز التقطيع المبرد عن طريق لصقه بكمية صغيرة من مادة مصفوفة الأنسجة المجمدة واتركه حتى يتجمد. 8. تُقطع المقاطع الروتينية بسمك 5 ميكرون وتُرفع على شريحة زجاجية، مثل شرائح Superfrost® Plus للمجهر. 10. جففها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. 11. ثبّت المقاطع في أسيتون بارد (-20 درجة مئوية) لمدة دقيقتين أو في مُثبّت مناسب آخر (مثل الكحول، أو الفورمالين الكحولي، أو الفورمالين، إلخ). ١٢. جفف الشرائح المثبتة تمامًا [عادةً ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة]. ١٣. خزّنها في مجمد بدرجة حرارة -٧٠ درجة مئوية حتى الاستخدام. ثانيًا: إجراء التلوين المناعي النسيجي القياسي للشرائح المجمدة. قم بإجراء جميع عمليات التحضين في حجرة رطبة، ولا تدع الشرائح تجف. يجب أيضًا إجراء فحوصات التحكم في النمط المتماثل والنظام، ويجب أن تتطابق مع النمط المتماثل لكل جسم مضاد أولي يتم اختباره. يرجى قراءة الإجراء بالكامل قبل تلوين الشرائح. ١. أخرج الشرائح المجمدة المُجهزة مسبقًا من المجمد واتركها حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. ٢. ضع علامة على جميع الشرائح بقلم حبر مقاوم للمذيبات، وحدد النسيج إذا لزم الأمر. ٣. اشطف الشرائح ٢-٣ مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) لإزالة وسائط التثبيت المجمدة. ٤. ضع محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز ٠.٠٣٪ في محلول الفوسفات الملحي (لمدة ١٠ دقائق تقريبًا) لتثبيط نشاط البيروكسيداز الداخلي. ٥. اشطف الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي مرة واحدة. ٦. امسح المحلول الزائد من حول العينة. ٧. قم بحجب التفاعلات باستخدام مصل طبيعي بنسبة ٥٪ مخفف في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) لمدة ١٥ دقيقة.* ٨. ضع الجسم المضاد الأولي المخفف في مخفف الأجسام المضادة BD Pharmingen™ للتلوين المناعي النسيجي (رقم المنتج ٥٥٩١٤٨) لتغطية مقاطع الأنسجة على الشريحة، ثم حضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في حجرة رطبة. ٩. اشطف الشرائح بثلاثة تغييرات من محلول ملحي فوسفاتي (PBS)، لمدة دقيقتين لكل تغيير. اختياري: احجب البيوتين الداخلي باستخدام محلول حجب البيوتين الداخلي، مثل مجموعة حجب البيوتين/أفيدين (مختبرات فيكتور، رقم المنتج SP-٢٠٠١) إذا كان النسيج يحتوي على بيوتين داخلي قد يسبب تلوينًا خلفيًا. ١٠. امسح الشريحة مرة أخرى، ثم ضع الجسم المضاد الثانوي المبيوتن المخفف في مخفف الأجسام المضادة BD Pharmingen™ للتلوين المناعي النسيجي (IHC)، واتركه ليحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة. يجب أن يكون هذا الجسم المضاد مطابقًا لنوع ونمط الجسم المضاد الأولي. ١١. اشطف الشرائح ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS)، لمدة دقيقتين في كل مرة. ١٢. امسح الشرائح مرة أخرى، ثم ضع عليها محلول ستربتأفيدين HRP باستخدام محلول BD Pharmingen™ Streptavidin HRP (رقم المنتج ٥٥٠٩٤٦) أو محلول تجاري مماثل يحتوي على ستربتأفيدين HRP، واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة. ١٣. اشطف الشرائح ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS)، لمدة دقيقتين في كل مرة. ١٤. حضّر الركيزة باستخدام مجموعة BD Pharmingen™ DAB Substrate Kit (رقم المنتج ٥٥٠٨٨٠) أو بديلًا عنها، حضّر ركيزة AEC باستخدام مجموعة BD Pharmingen™ AEC Substrate Kit (رقم المنتج ٥٥١٠١٥). ١٥. صفِّ محلول الفوسفات الملحي (PBS) من الشرائح، وضعها على سطح مستوٍ، ثم ضع محلول الركيزة مع التأكد من تغطية جميع أجزاء الشريحة بالمحلول. اترك الشرائح لتتشرب اللون، ثم افحصها بعد 5 دقائق أو حتى الوصول إلى درجة اللون المطلوبة. ينتج عن تفاعل إنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) لون بني من ركيزة DAB، بينما ينتج عن تفاعله مع ركيزة AEC لون أحمر. ملاحظة هامة: يرجى قراءة بيانات المخاطر والاحتياطات الخاصة بالركائز ومكونات هذه المجموعات بعناية قبل الاستخدام. يُشتبه في أن DAB مادة مسرطنة، لذا يجب التعامل معه بحذر. 16. التقط كل شريحة بالترتيب الذي وُضعت عليه الركيزة، وجفف محلول الركيزة الزائد على منشفة ورقية، ثم ضعها في حامل التلوين داخل طبق ماء. 17. اشطف الشرائح جيدًا بالماء 3 مرات. 18. تلوين الأنسجة: أ. اغمسها مرتين في الهيماتوكسيلين. ب. اشطفها جيدًا بالماء. 19. أضف قطرة أو قطرتين من وسط التثبيت المتوفر تجاريًا (مثل Aqua-Mount® Mounting Medium) على النسيج، ثم ضع غطاءً زجاجيًا فوقه، وأغلقه (باستخدام طلاء أظافر شفاف مثلاً) إذا رغبت في ذلك. ملاحظات: * استخدم دائمًا مصلًا من نفس نوع الكائن الحي الذي صُنع منه الجسم المضاد الثانوي؛ على سبيل المثال، إذا كان الجسم المضاد الثانوي هو جسم مضاد من الماعز ضد الغلوبولين المناعي للفأر، فقم بحجب التفاعل باستخدام 5% من مصل الماعز الطبيعي. حضّن لمدة 10-30 دقيقة قبل تطبيق الجسم المضاد الأولي. لا تشطف بعد هذه الخطوة (تخلص من محلول الحجب بالتربيت إذا كنت تستخدم حجرات رطبة) وانتقل مباشرةً إلى تطبيق الجسم المضاد الأولي. من المهم عدم استخدام أزيد الصوديوم في أي من المحاليل المنظمة عند استخدام بيروكسيداز الفجل، لأن الأزيد يُعطّل الإنزيم. تحضير وتلوين المقاطع النسيجية المضمنة في البارافين: المواد المطلوبة: محلول ملحي مُخفّف بالفوسفات (PBS)؛ متوفر تجاريًا: 10% فورمالين مُخفّف محايد للتلوين المناعي النسيجي؛ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)؛ كحولات متدرجة التركيز؛ زيلين؛ هيماتوكسيلين. أولًا: تثبيت ومعالجة الأنسجة للمقاطع النسيجية المضمنة في البارافين. يُرجى قراءة الإجراء بالكامل قبل تلوين الشرائح. أ. تثبيت الأنسجة في محلول فورمالين متعادل مخفف بنسبة 10%: 1. يجب تقطيع الأنسجة المراد تثبيتها ومعالجتها إلى شرائح لا يزيد سمكها عن 3 مم. تُترك الأنسجة لتثبت في محلول فورمالين متعادل مخفف بنسبة 10% في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 ساعات، على ألا تتجاوز المدة 24 ساعة. 2. اتبع جدول المعالجة الموصى به في القسم ج. بدائل تثبيت الأنسجة في مثبتات الزنك: 1. تُحجب العديد من الحواتم المستضدية أو حتى تُدمر عند التثبيت بالفورمالين بنسبة 10%. في بعض الحالات، يكون التثبيت في مثبت أخف، مثل مثبت الزنك BD Pharmingen™ IHC (رقم المنتج 550523) أو مثبت الزنك BD Pharmingen™ 10X (خالٍ من الفورمالين) [رقم المنتج 552658]، مفيدًا للحفاظ على الحواتم المستضدية. ضع الأنسجة الطازجة المقطعة إلى شرائح بسمك 3 مم في محلول التثبيت، واتركها لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة. 2. اتبع جدول المعالجة الموصى به في القسم CC: جدول المعالجة: ملاحظة: تتطلب معالجة قوالب البارافين وتضمينها وتقطيعها معدات وخبرات متخصصة للغاية، وعادةً ما يتم إجراؤها في مختبر علم الأنسجة أو علم الأمراض. على الرغم من إمكانية إجراء المعالجة اليدوية وفقًا للبروتوكول التالي، إلا أن النتائج قد تُظهر تباينًا ملحوظًا في جودة الأنسجة ومستوى المستضدات. المحطة الوقت المحلول 1 تأخير معالجة الأنسجة بالمثبت 2 45 دقيقة كحول 70% 3 45 دقيقة كحول 80% 4 45 دقيقة كحول 95% 5 45 دقيقة كحول 100% 6 60 دقيقة كحول 100% 7 60 دقيقة كحول 100% 8 60 دقيقة كاشف التصفية (زيلين أو بديل) 9 60 دقيقة كاشف التصفية (زيلين أو بديل) 10 60 دقيقة بارافين 1 11 60 دقيقة بارافين 2 12 60 دقيقة بارافين 3 II. تحضير الشرائح مع مقاطع البارافين للكيمياء المناعية النسيجية أ. تقطيع وتحضير الشرائح. 1. تقطيع كتل البارافين بالسُمك المطلوب (عادةً 4-5 ميكرومتر) على الميكروتوم ووضعها في حمام مائي يحتوي على ماء منزوع الأيونات أو مقطر. ٢. تُنقل المقاطع النسيجية على شريحة زجاجية، مثل شرائح المجهر Superfrost® Plus. ب. إزالة البارافين وإعادة ترطيب شرائح الأنسجة: ١. قبل إزالة البارافين، تُوضع الشرائح في فرن على درجة حرارة ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق لإذابة البارافين. تُزال البارافين من الشرائح باستخدام الزيلين أو بديل الزيلين مرتين، لمدة ٥ دقائق لكل مرة. ٢. تُنقل الشرائح إلى كحول ١٠٠٪، مرتين لمدة ٣ دقائق لكل مرة، ثم تُنقل مرة أخرى إلى كحول ٩٥٪ لمدة ٣ دقائق. ٣. يُثبط نشاط البيروكسيداز الداخلي عن طريق حضانة المقاطع في محلول بيروكسيد الهيدروجين ٣٪ في الميثانول لمدة ١٠ دقائق. ٤. تُشطف الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي مرتين، لمدة ٥ دقائق في كل مرة. اختياري: إذا تغير المستضد المراد فحصه أثناء عملية التثبيت، فيمكن تطبيق طريقة استرجاع المستضد. لاستعادة المستضد وكشف الإبيتوب المستضدي، استخدم الكواشف والبروتوكولات الموضحة في BD Pharmingen™ Retrievagen A (الأس الهيدروجيني 6.0) [رقم المنتج 550524] أو BD Pharmingen™ Retrievagen B (الأس الهيدروجيني 9.5) [رقم المنتج 550527]. 5. قم بحجب التفاعل باستخدام 5% من المصل الطبيعي. 6. خفف الجسم المضاد الأولي في محلول تخفيف الأجسام المضادة للتلوين المناعي النسيجي (رقم المنتج 559148) لتغطية مقاطع الأنسجة على الشريحة، ثم حضّنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل في حجرة رطبة. 7. في اليوم التالي، أخرج الشرائح من الثلاجة (4 درجات مئوية) وابدأ بالخطوة 9 من إجراء التلوين المناعي النسيجي القياسي. ملاحظة: من المهم عدم استخدام أزيد الصوديوم في أي من المحاليل المنظمة عند استخدام بيروكسيداز الفجل، لأن الأزيد يُعطّل الإنزيم. تحذير: يحتوي ستربتأفيدين HRP على 0.004% (وزن/وزن) من مزيج CMIT/MIT (3:1)، وهو مزيج من: 5-كلورو-2-ميثيل-4-أيزوثيازولين-3-ون [رقم EC 247-500-7] و2-ميثيل-4-أيزوثيازولين-3-ون [رقم EC 220-239-6] (3:1). بيانات المخاطر: قد يسبب رد فعل تحسسي جلدي. بيانات الاحتياطات: ارتدِ قفازات واقية ونظارات واقية. ارتدِ ملابس واقية. تجنب استنشاق الرذاذ/الأبخرة. في حالة حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيباً. في حالة ملامسة الجلد: اغسل جيداً بالماء. تخلص من المحتويات/العبوة وفقاً للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية.
إشعارات المنتج: يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. المكون الخطير: ProClin™ 150. تجنب ملامسة الجلد والعينين والابتلاع. اغسل الجلد المُعرَّض بالماء والصابون. اشطف العينين بالماء. يُرجى مراجعة http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS). ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas. للاطلاع على براءات الاختراع الأمريكية التي قد تنطبق، يُرجى زيارة bd.com/patents.