BD، 551008، BD Pharmingen™ AKP Streptavidin

التطبيق: الكيمياء المناعية النسيجية (يتم اختبارها بشكل روتيني)
RRID: AB_10051240
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA ومثبت البروتين و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم ربط الستربتافيدين بالإنزيم في ظل ظروف مثالية. يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات الفحص الموصى بها: إجراءات الفحص الموصى بها: التحضير والتلوين المناعي النسيجي للشرائح المجمدة. المواد المطلوبة: محلول ملحي فوسفاتي (PBS)؛ 2-ميثيل بيوتان (أيزوبنتان)؛ أسيتون؛ نيتروجين سائل؛ ثلج جاف؛ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)؛ كحولات متدرجة التركيز؛ قوالب تضمين زيلين Peel-A-Way® (شركة Polysciences Inc.، وارينغتون، بنسلفانيا). مركب OCT لتجميد الأنسجة ومواد التضمين (Tissue-Tek®؛ شركة Sakura Finetek USA). نظام الركيزة السائلة BCIP®/NBT (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات/ بارا-أيودونيتروتترازوليوم) (شركة Sigma-Aldrich). أولاً: تثبيت ومعالجة وتقطيع الأنسجة للشرائح المجمدة. 1. ضع علامة على قالب التضمين واملأ القالب جزئيًا بمركب OCT. ٢. ضع عينة النسيج الطازجة في قوالب التضمين المُعَلَّمة مسبقًا. ٣. اغمر قالب التضمين مع النسيج في ٢-ميثيل بيوتان مُبَرَّد مسبقًا في وعاء ديوار مملوء بالنيتروجين السائل حتى يكاد القالب يتجمد (٣٠ ثانية). ملاحظة: إذا تُرك القالب لفترة أطول من اللازم، فقد يتشقق. ٤. أخرج قالب النسيج من ٢-ميثيل بيوتان باستخدام ملقط طويل. ٥. ضع الأنسجة المُجمدة على الثلج الجاف. (يمكن تخزين الأنسجة في قوالب التضمين). ٦. خزِّن قوالب الأنسجة المُجمدة في مُجمِّد بدرجة حرارة -٧٠ درجة مئوية حتى تقطيعها. ٧. للتقطيع، ثبِّت قالب النسيج المُجمد على حامل جهاز التقطيع المُجمد عن طريق لصقه بكمية صغيرة من مادة مُصفوفة الأنسجة المُجمدة واتركه حتى يتجمد. ٨. تُقطع المقاطع الروتينية بسمك ٥ ميكرون وتُرفع على شريحة زجاجية، مثل شرائح Superfrost® Plus للمجهر. ١٠. جففها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. 11. ثبّت المقاطع في الأسيتون البارد (-20 درجة مئوية) لمدة دقيقتين أو في مُثبِّت مناسب آخر (مثل الكحول، أو الفورمالين الكحولي، أو الفورمالين، إلخ). 12. جفف الشرائح المُثبَّتة تمامًا [عادةً ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة]. 13. خزِّنها في مُجمِّد عند درجة حرارة -70 درجة مئوية حتى الاستخدام. ثانيًا: إجراء التلوين المناعي النسيجي القياسي للمقاطع المُجمَّدة. قم بإجراء جميع عمليات التحضين في حجرة رطبة، ولا تدع المقاطع تجف. يجب أيضًا إجراء فحوصات التحكم في النمط المتماثل والنظام، ويجب أن تتطابق مع النمط المتماثل لكل جسم مضاد أولي يتم اختباره. المواد المطلوبة: محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS)، نظام الركيزة السائلة BCIP®/NBT (سيجما-ألدريتش). يُرجى قراءة الإجراء بالكامل قبل تلوين الشرائح. 1. أخرج الشرائح المُجمَّدة المُجهَّزة مُسبقًا من المُجمِّد واتركها حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. 2. ضع علامة على جميع الشرائح بقلم حبر مقاوم للمذيبات، وحدد النسيج إذا لزم الأمر. 3. اشطف الشرائح مرتين إلى ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) لإزالة وسط التثبيت المتجمد. 4. ضع محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 0.03% في محلول الفوسفات الملحي (لمدة 10 دقائق تقريبًا) لتثبيط نشاط البيروكسيداز الداخلي. 5. اشطف الشرائح مرة واحدة بمحلول الفوسفات الملحي. 6. امسح المحلول الزائد حول العينة. 7. قم بحجب التفاعلات باستخدام مصل طبيعي بتركيز 5% مخفف في محلول الفوسفات الملحي لمدة 15 دقيقة.* 8. ضع الجسم المضاد الأولي المخفف في مخفف الأجسام المضادة BD Pharmingen™ للتلوين المناعي النسيجي (رقم المنتج 559148) لتغطية مقاطع الأنسجة على الشريحة، ثم حضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في حجرة رطبة. 9. اشطف الشرائح ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي، لمدة دقيقتين في كل مرة. اختياري: قم بحجب البيوتين الداخلي باستخدام محلول حجب البيوتين الداخلي، مثل مجموعة حجب البيوتين/أفيدين (مختبرات فيكتور، رقم المنتج SP-2001) إذا كان النسيج يحتوي على بيوتين داخلي قد يسبب تلوينًا خلفيًا. 10. امسح الشريحة مرة أخرى وضع الجسم المضاد الثانوي المُبيوتيني المخفف في مخفف الأجسام المضادة BD Pharmingen™ للتلوين المناعي النسيجي، واتركه ليحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. يجب أن يكون هذا الجسم المضاد مطابقًا للتعرف على نوع ونمط الجسم المضاد الأولي. 11. اشطف الشرائح بثلاثة تغييرات من محلول الفوسفات الملحي (PBS)، لمدة دقيقتين لكل تغيير. 12. امسح مرة أخرى وضع ستربتأفيدين AKP باستخدام ستربتأفيدين AKP من BD Pharmingen™ (رقم المنتج 551008) على كل شريحة، واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. 13. اشطف الشرائح بثلاثة تغييرات من محلول الفوسفات الملحي (PBS)، لمدة دقيقتين لكل تغيير. ١٤. حضّر BCIP/NBT كركيزة مُلوِّنة للفوسفاتاز القلوي. يُستخدم BCIP/NBT على نطاق واسع كصبغة في التلوين المناعي النسيجي، مثل نظام الركيزة السائلة BCIP®/NBT (سيجما-ألدريتش). ١٥. صفِّ محلول الفوسفات الملحي (PBS) من الشرائح، وضعها على سطح مستوٍ، ثم ضع محلول ركيزة BCIP/NBT مع التأكد من تغطية المقطع بالكامل بالمحلول. اترك الشرائح لتتحضَّن، ثم افحصها بعد ٥ دقائق أو حتى الوصول إلى شدة اللون المطلوبة. يتفاعل الفوسفاتاز القلوي مع BCIP/NBT لإنتاج ناتج نهائي غير قابل للذوبان من ثنائي فورمازان NBT، يتراوح لونه بين الأزرق والبنفسجي. هذا الناتج النهائي قابل للذوبان في الكحول، لذا يجب استخدامه مع صبغة مضادة مائية ووسط تثبيت. ١٦. اشطف الشرائح جيدًا بالماء ٣ مرات. ١٧. لوِّن الأنسجة حسب الرغبة. ١٨. أضف قطرة أو قطرتين من وسط تثبيت متوفر تجاريًا (مثل وسط التثبيت Aqua-Mount®) على النسيج، ثم ضع غطاءً زجاجيًا فوقه، وأحكم إغلاقه (باستخدام طلاء أظافر شفاف مثلًا) إذا رغبت في ذلك. ملاحظات: * استخدم دائمًا مصلًا من نفس نوع الكائن الحي الذي صُنع منه الجسم المضاد الثانوي: أي، إذا كان الجسم المضاد الثانوي هو جسم مضاد من الماعز ضد الغلوبولين المناعي للفأر، فقم بحجبه بمصل ماعز طبيعي بنسبة ٥٪. حضّن لمدة ١٠-٣٠ دقيقة قبل وضع الجسم المضاد الأولي. لا تشطف بعد هذه الخطوة (تخلص من محلول الحجب بالتربيت إذا كنت تستخدم حجرات رطبة)، وانتقل مباشرةً إلى وضع الجسم المضاد الأولي. تحضير وتلوين المقاطع النسيجية المضمنة في البارافين: المواد المطلوبة: محلول ملحي فوسفاتي (PBS)؛ متوفر تجاريًا: فورمالين متعادل مخفف بنسبة ١٠٪ للتلوين المناعي النسيجي؛ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)؛ كحول متدرج التركيز؛ زيلين؛ هيماتوكسيلين. أولاً: تثبيت ومعالجة الأنسجة لشرائح البارافين. يُرجى قراءة الإجراء بالكامل قبل تلوين الشرائح. أ. تثبيت الأنسجة في محلول فورمالين متعادل مخفف بنسبة 10%: 1. يجب تقطيع الأنسجة المراد تثبيتها ومعالجتها إلى شرائح لا يزيد سمكها عن 3 مم. تُترك الأنسجة لتثبت في محلول فورمالين متعادل مخفف بنسبة 10% متوفر تجاريًا في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 ساعات، على ألا تتجاوز المدة 24 ساعة. 2. اتبع جدول المعالجة الموصى به في القسم ج. بدائل تثبيت الأنسجة في مثبتات الزنك: 1. يتم حجب العديد من الحواتم المستضدية أو حتى تدميرها بواسطة التثبيت بالفورمالين بنسبة 10%. في بعض الحالات، يمكن استخدام مثبت أخف مثل مثبت الزنك BD Pharmingen™ IHC (رقم المنتج 550523) أو مثبت الزنك BD Pharmingen™ 10X (خالٍ من الفورمالين) [رقم المنتج 550523]. [رقم 552658] مفيد للحفاظ على المستضدات. ضع الأنسجة الطازجة المقطعة إلى سمك 3 مم في محلول التثبيت واتركها لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة. 2. اتبع جدول المعالجة الموصى به في القسم CC: جدول المعالجة: ملاحظة: تتطلب معالجة قوالب البارافين وتضمينها وتقطيعها معدات وخبرات متخصصة للغاية، وعادةً ما يتم إجراؤها في مختبر علم الأنسجة أو علم الأمراض. على الرغم من إمكانية إجراء المعالجة اليدوية وفقًا للبروتوكول التالي، إلا أن النتائج قد تُظهر تباينًا ملحوظًا في جودة الأنسجة والمستضدات. المحطة الوقت المحلول 1 تأخير معالجة الأنسجة بالمثبت 2 45 دقيقة كحول 70% 3 45 دقيقة كحول 80% 4 45 دقيقة كحول 95% 5 45 دقيقة كحول 100% 6 60 دقيقة كحول 100% 7 60 دقيقة كحول 100% 8 60 دقيقة كاشف التصفية (زيلين أو بديل) 9 60 دقيقة كاشف التصفية (زيلين أو بديل) 10 60 دقيقة بارافين 1 11 60 دقيقة بارافين 2 12 60 دقيقة بارافين 3 II. تحضير الشرائح مع مقاطع البارافين للكيمياء المناعية النسيجية أ. تقطيع وتحضير الشرائح. 1. تقطيع كتل البارافين بالسُمك المطلوب (عادةً 4-5 ميكرومتر) على الميكروتوم ووضعها في حمام مائي يحتوي على ماء منزوع الأيونات أو مقطر. ٢. تُنقل المقاطع النسيجية على شريحة زجاجية، مثل شرائح المجهر Superfrost® Plus. ب. إزالة البارافين وإعادة ترطيب شرائح الأنسجة: ١. قبل إزالة البارافين، تُوضع الشرائح في فرن على درجة حرارة ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق لإذابة البارافين. تُزال البارافين من الشرائح باستخدام الزيلين أو بديل الزيلين مرتين، لمدة ٥ دقائق لكل مرة. ٢. تُنقل الشرائح إلى كحول ١٠٠٪، مرتين لمدة ٣ دقائق لكل مرة، ثم تُنقل مرة أخرى إلى كحول ٩٥٪ لمدة ٣ دقائق. ٣. يُثبط نشاط البيروكسيداز الداخلي عن طريق حضانة المقاطع في محلول بيروكسيد الهيدروجين ٣٪ في الميثانول لمدة ١٠ دقائق. ٤. تُشطف الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي مرتين، لمدة ٥ دقائق في كل مرة. اختياري: إذا تغير المستضد المراد فحصه أثناء عملية التثبيت، فيمكن تطبيق طريقة استرجاع المستضد. لاستعادة المستضد وكشف الإبيتوب المستضدي، استخدم الكواشف والبروتوكولات الموضحة في BD Pharmingen™ Retrievagen A (الأس الهيدروجيني 6.0) [رقم المنتج 550524] أو BD Pharmingen™ Retrievagen B (الأس الهيدروجيني 9.5) [رقم المنتج 550527]. 5. قم بحجب التفاعل باستخدام مصل طبيعي بنسبة 5%. 6. خفف الجسم المضاد الأولي في محلول تخفيف الأجسام المضادة للتلوين المناعي النسيجي (رقم المنتج 559148) لتغطية مقاطع الأنسجة على الشريحة، ثم حضّنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل في حجرة رطبة. 7. في اليوم التالي، أخرج الشرائح من الثلاجة (4 درجات مئوية) وابدأ بالخطوة 9 من إجراء التلوين المناعي النسيجي القياسي. لاحظ لون تلوين الجسم المضاد في مقاطع الأنسجة تحت المجهر.
إشعارات المنتج: يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يُرجى مراجعة http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS). للاطلاع على براءات الاختراع الأمريكية التي قد تنطبق، يُرجى زيارة bd.com/patents.