BD، 551263، BD™ DimerX DimerX I: بروتين اندماجي بشري ثنائي قابل للذوبان معاد التركيب HLA-A2:Ig

التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم التعبير عن بروتين HLA-A2 مع بروتين β2M البشري في سلالة خلايا ورم البلازما الفأري J558L (ATCC TIB-6). ترتبط سلاسل عديد الببتيد HLA-A2 وβ2M بروابط غير تساهمية نتيجةً للتعبير المشترك عنهما داخل خلايا J558L. تم تنقية بروتين الاندماج HLA-A2:Ig من سائل مزرعة الأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم التأكد من نقاء المستحضر بواسطة SDS-PAGE.
إجراءات الفحص الموصى بها: تم اختبار بروتين الاندماج HLA-A2:Ig هذا باستخدام التلوين المناعي الفلوري (≤ 2 ميكروغرام HLA-A2:Ig/مليون خلية) (انظر الشكل) وتحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية النوعية للمستضد لضمان النوعية والتفاعل. من الضروري تحميل أجزاء HLA-A2 من البروتين الثنائي بببتيد ذي صلة قبل التلوين المناعي الفلوري للخلايا التائية. يتم تحميل معقدات HLA-A2:Ig بكفاءة عن طريق الحضانة مع فائض من الببتيدات ذات الصلة (النوعية) أو غير ذات الصلة (الضابطة) (انظر البروتوكول 1). يمكن استخدام HLA-A2:Ig المحمل بالببتيد للتلوين المناعي الفلوري (انظر البروتوكول 2). يُعد الجسم المضاد أحادي النسيلة BB7.2 المرتبط بـ FITC (المضاد لـ HLA-A2 البشري، رقم المنتج 551285) مفيدًا لتحديد النمط الظاهري A2 للخلايا قبل تلوينها ببروتين الاندماج HLA-A2:Ig. ونظرًا لاختلاف التطبيقات، يجب على كل باحث تحديد التخفيفات المناسبة لاستخدامه الفردي. البروتوكول 1: تحميل الببتيد على بروتين HLA-A2:Ig الثنائي. وُصفت عدة بروتوكولات لتحميل الببتيد. تتضمن الطريقة المستخدمة في BD Biosciences Pharmingen التحميل السلبي للببتيد الزائد في محلول مع بروتين HLA-A2:Ig. وقد وجدنا أن التحميل السلبي فعال بشكل خاص في حالة الببتيدات ذات الألفة العالية. أما بالنسبة للببتيدات ذات الألفة المنخفضة، فقد يؤدي زيادة النسبة المولية للببتيد إلى HLA-A2:Ig إلى تحسين التحميل، كما تم تحديده بواسطة تحليل التدفق الخلوي. يُقترح أن يقوم الباحث، لكل ببتيد، بتحديد معايير مثل جرعة HLA-A2:Ig لكل مليون خلية، والنسبة المولية للببتيد إلى HLA-A2:Ig، ووقت تحميل الببتيد تجريبيًا. وقد وردت في الأدبيات العلمية معايير ومتطلبات أساسية لارتباط الببتيد بـ HLA-A2. بينما يحتوي منتج DimerX هذا على β2 ميكروغلوبولين، فإننا نوصي الباحثين الذين يحتاجون إلى كمية زائدة من β2 ميكروغلوبولين البشري المؤتلف، باستخدام منتج BD Biosciences رقم 551089. تحضير الببتيد وتحميله: 1. يجب تحديد الوزن الجزيئي (MW) للببتيد المطلوب. يمكن تقدير الوزن الجزيئي للببتيد بضرب عدد الأحماض الأمينية (n) فيه في 130 دالتون (d) لكل حمض أميني: الوزن الجزيئي للببتيد (d) = n (عدد الأحماض الأمينية) × 130 (d/عدد الأحماض الأمينية). 2. يمكن تحضير محلول أساسي من الببتيد بتركيز 20 ملغم/مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يُخفف محلول الببتيد إلى تركيز 2 ملغم/مل في محلول DPBS معقم، بدرجة حموضة 7.2، لاستخدامه في بروتوكول تحميل HLA-A2:Ig. 3. يُخلط بروتين HLA-A2:Ig مع الببتيد المحدد أو ببتيد التحكم بزيادة مولية قدرها 40 أو 160 أو 640 مولار. يمكن استخدام الحساب التالي، باستخدام ببتيد مكون من 8 أحماض أمينية (8mer) كمثال: Dp = الوزن الجزيئي للببتيد: على سبيل المثال، 8 أحماض أمينية × 130 = 1040 دالتون. DA = الوزن الجزيئي لـ HLA-A2:Ig = 250,000 دالتون. R = النسبة المولية الزائدة المطلوبة، على سبيل المثال، 160. Mp = ميكروغرام (ميكروغرام) من الببتيد المطلوب. MA = ميكروغرام (ميكروغرام) من HLA-A2:Ig في التفاعل. الكمية النموذجية من HLA-A2:Ig المحمّل بالببتيد والمستخدمة في تلوين قياس التدفق الخلوي هي من 1 إلى 2 ميكروغرام/مليون خلية (للاختبار). Mp = MA × R × Dp = 4 ميكروغرام × 160 × 1040 دالتون = 2.66 ميكروغرام DA / 250,000 دالتون. لذلك، يُضاف 2.66 ميكروغرام من الببتيد و4 ميكروغرام من HLA-A2:Ig إلى المحلول للحصول على التحميل الأمثل للببتيد على HLA-A2:Ig. ٤. امزج الببتيد وHLA-A2:Ig معًا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بدرجة حموضة ٧.٢، ثم حضّن المزيج عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية طوال الليل. يمكن تخزين HLA-A2:Ig المحمّل بالببتيد عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. البروتوكول ٢: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري ١. أعد تعليق الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) أو الخلايا المستهدفة في محلول تلوين FACS [مثل محلول التلوين BD Pharmingen™ مع BSA، رقم المنتج ٥٥٤٦٥٧]، بتركيز يقارب ١٠⁶ خلية لكل ٥٠ ميكرولتر. أضف حوالي ١٠⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب ١٢ × ٧٥ مم، BD Falcon™، رقم المنتج ٣٥٢٠٠٨). ٢. حضّر مزيج تلوين بروتين HLA-A2 المحمّل بالببتيد عن طريق مزج ١-٢ ميكروغرام من بروتين HLA-A2 المحمّل بالببتيد لكل عينة مع ١-٢ ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج ٥٥٠٠٨٣) لكل عينة بنسبة ١:١ أو ١:٢ من ثنائي الوحدات: الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1. حضّن المزيج لمدة ٦٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. ٣. أضف ١-٢ ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A111-3 النقي من نوع IgG1 للفأر (رقم المنتج ٥٥٣٤٨٥) لكل عينة إلى مزيج التلوين (انظر الخطوة ٢ أعلاه). حضّن مزيج التلوين لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. ٤. حضّر الغلوبولين المناعي البشري IgG متعدد النسائل النقي بتركيز ٠٫٢ ملغم/مل تقريبًا في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) بدرجة حموضة ٧٫٢. ٥. أضف ١٠ ميكرولتر (٢ ميكروغرام) من محلول IgG البشري المركز لكل أنبوب لمنع الارتباط غير النوعي لـ DimerX I أو كواشف الأجسام المضادة بمستقبلات Fc السطحية. حضّن لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ٦. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول FACS الذي يحتوي على الكمية المثلى لكل اختبار من مزيج التلوين، بالإضافة إلى أي أجسام مضادة أخرى خاصة بعلامات سطح الخلية لاستخدامها مع كل عينة. ٧. اغسل الخلايا مرة واحدة بـ ٢ مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × g، واسحب السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا في محلول FACS وحللها باستخدام قياس التدفق الخلوي.* *ضمن مجموعة الخلايا، يكون تردد الخلايا القادرة على التعرف على معقدات الببتيد-MHC النوعية منخفضًا جدًا عادةً، على سبيل المثال، أقل من ١٪. نوصي بالحصول على ما لا يقل عن 100,000 خلية ليمفاوية لتحليل التدفق الخلوي من أجل الكشف الأمثل عن هذه المجموعة الفرعية. البروتوكول 3: بديل: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري 1. أعد تعليق الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي أو الخلايا المستهدفة في محلول تلوين FACS [مثل محلول التلوين BD Pharmingen™ مع BSA، رقم المنتج 554657]، بتركيز يقارب 10 × 10⁶ خلية لكل 50 ميكرولتر. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™، رقم المنتج 352008). 2. حضّر الغلوبولين المناعي IgG البشري متعدد النسائل النقي بتركيز يقارب 0.2 ملغم/مل في محلول ملحي فوسفاتي (PBS)، درجة الحموضة 7.2. 3. أضف 10 ميكرولتر (2 ميكروغرام) من محلول IgG البشري المركز لكل أنبوب لمنع الارتباط غير النوعي لـ DimerX I أو كواشف الأجسام المضادة بمستقبلات Fc السطحية. حضّن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. 4. أضف من 1 إلى 2 ميكروغرام من بروتين HLA-A2:Ig المحمّل بالببتيد إلى كل عينة. حضّن لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. 5. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 × g، واسحب السائل الطافي. 6. أضف مرة أخرى 10 ميكرولتر (2 ميكروغرام) من IgG البشري متعدد النسائل النقي لكل عينة. حضّن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. 7. أضف 100 ميكرولتر من محلول FACS الذي يحتوي على كاشف ثانوي فلوري مخفف بشكل مناسب. نستخدم عادةً الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج 550083). حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.** 8. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 × g، واسحب السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا في محلول FACS وحللها باستخدام قياس التدفق الخلوي.*** **يمكن إضافة أجسام مضادة إضافية خاصة بعلامات مثل CD4 أو CD8 أو HLA-A2 في هذه الخطوة عن طريق إضافة أجسام مضادة مرتبطة بصبغة فلورية مخففة بشكل مناسب. ملاحظة: BD™ Dimerx HLA-A2:Ig هو بروتين اندماجي يحتوي على مناطق السلسلة الثقيلة من IgG1 للفأر. لذلك، من المهم اختيار كواشف من نمط نظيري مختلف لتجنب التلوين المحتمل بواسطة الكاشف الثانوي (مضاد IgG1) مع كواشف الأجسام المضادة الأخرى هذه. ***ضمن مجموعة الخلايا، يكون تردد الخلايا القادرة على التعرف على معقدات الببتيد-MHC المحددة منخفضًا جدًا عادةً، على سبيل المثال، أقل من 1%. نوصي بالحصول على ما لا يقل عن 100,000 خلية ليمفاوية لتحليلها بتقنية قياس التدفق الخلوي من أجل الكشف الأمثل عن هذه المجموعة الفرعية.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.