BD، 551323، BD™ DimerX DimerX I: بروتين غلوبولين مناعي ثنائي قابل للذوبان معاد التركيب من الفأر H-2D[b]:Ig

النمط المصلي: IgG1 الفأري، λ
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_2868932
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
إجراءات الفحص الموصى بها: تم اختبار بروتين الاندماج H-2D[b]:Ig هذا باستخدام التلوين المناعي الفلوري (≤ 4 ميكروغرام H-2D[b]:Ig/مليون خلية) (انظر الشكل 2) وتحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية النوعية للمستضد لضمان النوعية والتفاعل. من الضروري تحميل أجزاء H-2D[b] من البروتين الثنائي بببتيد ذي صلة قبل التلوين المناعي الفلوري للخلايا التائية. يتم تحميل معقدات H-2D[b]:Ig بكفاءة عن طريق الحضانة مع فائض من الببتيدات ذات الصلة (النوعية) أو غير ذات الصلة (الضابطة) (انظر البروتوكول 1). يمكن استخدام H-2D[b]:Ig المحمل بالببتيد للتلوين المناعي الفلوري (انظر البروتوكول 2). نظرًا لاختلاف التطبيقات، يجب على كل باحث تحديد التخفيفات المناسبة للاستخدام الفردي. البروتوكول 1: تحميل الببتيدات على بروتين H-2D[b]:Ig الثنائي. وُصفت عدة بروتوكولات لتحميل الببتيدات. تعتمد الطريقة المستخدمة في شركة BD Biosciences Pharmingen على التحميل السلبي للببتيد الزائد في محلول مع بروتين H-2D[b]:Ig. وقد وجدنا أن التحميل السلبي فعالٌ للغاية، خاصةً مع الببتيدات ذات الألفة العالية. أما بالنسبة للببتيدات ذات الألفة المنخفضة، فقد يؤدي رفع النسبة المولية للببتيد إلى بروتين H-2D[b]:Ig إلى تحسين التحميل، كما تم تحديده بواسطة تحليل التدفق الخلوي. يُقترح أن يقوم الباحث، لكل ببتيد، بتحديد معايير تجريبية مثل جرعة بروتين H-2D[b]:Ig لكل مليون خلية، والنسبة المولية للببتيد إلى بروتين H-2D[b]:Ig، ووقت تحميل الببتيد. تم الإبلاغ عن معايير ارتباط الببتيد بـ H-2D[b]، بما في ذلك الببتيدات المستخدمة بشكل روتيني في BD Biosciences Pharmingen لتقييم H-2D[b]:Ig. بينما يحتوي منتج DimerX هذا على β2 ميكروغلوبولين، نوصي الباحثين الذين يحتاجون إلى كمية زائدة من β2 ميكروغلوبولين البشري المؤتلف، باستخدام منتج BD Biosciences رقم 551089. تحضير الببتيد وتحميله: 1. يجب تحديد الوزن الجزيئي (MW) للببتيد المطلوب. يمكن تقدير الوزن الجزيئي للببتيد بضرب عدد الأحماض الأمينية (AA) فيه (n) في 130 دالتون (d) لكل حمض أميني: الوزن الجزيئي للببتيد (d) = n (AA) × 130 (d/AA). 2. يمكن تحضير محلول أساسي من الببتيد بتركيز 20 ملغم/مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). خفف محلول الببتيد إلى تركيز 2 ملغم/مل في محلول DPBS معقم، بدرجة حموضة 7.2، لاستخدامه في بروتوكول تحميل H-2D[b]:Ig. 3. امزج بروتين H-2D[b]:Ig مع ببتيد محدد أو ببتيد تحكم بفائض مولاري (M) قدره 40 أو 160 أو 640. يمكن استخدام الحساب التالي، باستخدام ببتيد مكون من 8 أحماض أمينية (8mer) كمثال: Dp = الوزن الجزيئي للببتيد: على سبيل المثال، 8 أحماض أمينية × 130 = 1040 دالتون. DDb = الوزن الجزيئي لـ H-2Db:Ig = 250000 دالتون. R = النسبة المولية الزائدة المطلوبة، على سبيل المثال، 160. Mp = ميكروغرام (ميكروغرام) من الببتيد المطلوب. MDb = ميكروغرام (ميكروغرام) من H-2Db:Ig في التفاعل. تتراوح الكمية النموذجية من H-2Db:Ig المحمّل بالببتيد والمستخدمة في تلوين الخلايا بتقنية قياس التدفق الخلوي بين 0.25 و4 ميكروغرام لكل مليون خلية (للاختبار). Mp = MDb × R × Dp ÷ DDb = 4 ميكروغرام × 160 × 1040 d ÷ 250000 d = 2.66 ميكروغرام. لذا، يُضاف 2.66 ميكروغرام من الببتيد و4 ميكروغرام من H-2D[b]:Ig إلى المحلول للحصول على التحميل الأمثل للببتيد على H-2D[b]:Ig. يُخلط الببتيد وH-2D[b]:Ig معًا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بدرجة حموضة 7.2، ويُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية طوال الليل. يمكن تخزين H-2D[b]:Ig المحمّل بالببتيد عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. البروتوكول 2: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري 1. تحضير مزيج تلوين بروتين H-2D[b] المحمل بالببتيد عن طريق مزج 0.25-4 ميكروغرام من بروتين H-2D[b] المحمل بالببتيد لكل عينة مع 0.25-4 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج 550083) لكل عينة بنسبة 1:1 أو 1:2 من ثنائي الوحدات: الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1. حضن المزيج لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. 2. إضافة 0.25-4 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A111-3 النقي من نوع IgG1 للفأر (رقم المنتج 553485) لكل عينة إلى مزيج التلوين (انظر الخطوة 1 أعلاه). حضّن مزيج التلوين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. 3. أعد تعليق خلايا الفأر في محلول تلوين FACS [مثل DPBS، 1% FCS، 0.09% NaN3 أو محلول تلوين BD Pharmingen™ (FBS)، رقم المنتج 554656]، الذي يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد أحادي النسيلة BD Fc Block™ المضاد للفأر CD16/CD32 2.4G2 (رقم المنتج 553141/553142)، بتركيز 10^6 خلية تقريبًا لكل 50 ميكرولتر. حضّن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف حوالي 1 × 10^6 خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™، رقم المنتج 352008). ٤. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول FACS الذي يحتوي على الكمية المثلى من مزيج التلوين لكل اختبار إلى كل عينة، بالإضافة إلى أي أجسام مضادة أخرى خاصة بعلامات سطح الخلية. حضّن لمدة ٦٠ دقيقة عند ٤ درجات مئوية. ٥. اغسل الخلايا مرتين باستخدام ٢ مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × g، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي ٠.٥ مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي. البروتوكول ٣: بديل: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري ١. أعد تعليق خلايا الفأر في محلول تلوين FACS [مثل DPBS، ١٪ FCS، ٠.٠٩٪ NaN3 أو محلول تلوين BD Pharmingen™ (FBS)، رقم المنتج. 554656]، يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد أحادي النسيلة 2.4G2 المضاد للفأر CD16/CD32 من BD Fc Block™ (رقم المنتج 553141/553142)، بتركيز يقارب 10^6 خلية لكل 50 ميكرولتر. حضّن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف حوالي 1 × 10^6 خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™ رقم المنتج 352008). 2. أضف من 0.25 إلى 4 ميكروغرام من بروتين H-2D[b]:Ig المحمّل بالببتيد إلى معلق الخلايا. حضّن لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. 3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 × g، واسحب السائل الطافي. ٤. أعد تعليق الخلايا في ١٠٠ ميكرولتر من محلول FACS المحتوي على كاشف ثانوي فلوري مخفف بشكل مناسب. نستخدم عادةً الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج ٥٥٠٠٨٣). حضّن لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة عند ٤ درجات مئوية. ٥. اغسل الخلايا مرتين باستخدام ٢ مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × g، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي ٠.٥ مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.