BD، 552576، مجموعة BD OptEIA™ Mouse IgG2a ELISA

التفاعل: الفأر (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2868964
الوصف: تحتوي مجموعة OptEIA™ الخاصة بـ IgG2a الفأري على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لـ IgG2a الفأري الطبيعي أو النقي في المصل والبلازما وسوائل مزارع الخلايا. تُوفر مواد كافية لتحضير ما يقارب 20 صفيحة من 96 بئرًا، شريطة اتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموصى بها والمحددة في هذه العبوة. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA™ تصميمًا مرنًا للفحص ليناسب احتياجات كل مختبر على حدة. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: الالتقاط، الكشف، معايرة الأجسام المضادة، وقت الحضانة، درجة حرارة الحضانة، تركيبة مخفف الفحص، درجة حموضة المحلول المنظم، القوة الأيونية، تركيز البروتين، نوع الركيزة، تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع).
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA™ B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف التحليل، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية - كربونات الصوديوم 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ 7.13 غرام من بيكربونات الصوديوم، 1.59 غرام من كربونات الصوديوم؛ يُكمل الحجم إلى 1.0 لتر؛ تُضبط درجة الحموضة إلى 9.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 مولار. يُحضر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف التحليل - محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة حتى 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُنشَّط حراريًا). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول الغسل - محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات* مع 0.05% توين-20. يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 4. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يوصى باستخدام مجموعة كواشف BD Pharmingen™ TMB Substrate Reagent Set (رقم المنتج 555214). 5. محلول الإيقاف - 1 مولار H3PO4 أو 2 مولار H2SO4. المواد الإضافية المطلوبة: 1. يوصى باستخدام صفائح BD Falcon™ ELISA ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح دقيقة قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة آلية للبيانات. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو غشاء بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. السائل الطافي لمزارع الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان. البلازما: اجمع البلازما باستخدام السترات أو EDTA أو الهيبارين كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g في غضون 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد تسخين المعيار المجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المحلول القياسي المجفف بالتجميد بإضافة 1.0 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول قياسي مركز. اترك المحلول القياسي حتى يصل إلى حالة التوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: بعد إعادة التكوين، قسّم المحلول القياسي المركز فورًا إلى أجزاء متساوية في قوارير بولي بروبيلين، 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّنها عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمها إلى أجزاء متساوية وتجميدها. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة. 3. تحضير المحاليل القياسية للتحليل: أ. حضّر محلولًا قياسيًا بتركيز 200 نانوغرام/مل من المحلول القياسي المركز. رجّ المحلول جيدًا باستخدام جهاز الرجّ. (راجع تعليمات التخفيف في شهادة التعليمات/التحليل). ب. أضف 300 ميكرولتر من مخفف التحليل إلى 6 أنابيب. قم بتسمية العينات بالتركيزات التالية: 100 نانوغرام/مل، 50 نانوغرام/مل، 25 نانوغرام/مل، 12.5 نانوغرام/مل، 6.3 نانوغرام/مل، و3.1 نانوغرام/مل. ج. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة بإضافة 300 ميكرولتر من كل معيار إلى الأنبوب التالي مع الخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي بين كل عملية نقل. يُستخدم مخفف الفحص كمعيار صفري (0 بيكوغرام/مل). المعايرة: تتم معايرة هذا الفحص المناعي باستخدام IgG2a الفأري النقي. إجراء الفحص بالتفصيل: 1. قم بتغطية الآبار الدقيقة بـ 100 ميكرولتر لكل بئر من الأجسام المضادة المُلتقطة المخففة في محلول التغطية. للاطلاع على التخفيف الموصى به لتغطية الأجسام المضادة، راجع التعليمات/شهادة التحليل الخاصة بالدفعة. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. 2. اسحب المحلول من الآبار واغسلها 3 مرات باستخدام 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة وجففها بورق ماص لإزالة أي محلول منظم متبقٍ. 3. أغلق الصفائح بـ 200 ميكرولتر أو أكثر من مخفف المعايرة لكل بئر. حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 4. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2. 5. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف المعايرة. انظر "تحضير المعايير والتعامل معها". 6. اسحب 100 ميكرولتر من كل معيار وعينة وعينة تحكم باستخدام ماصة وضعها في الآبار المناسبة. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 7. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2، ولكن مع 5 غسلات إجمالاً. 8. أضف 100 ميكرولتر من جسم الكشف المضاد المخفف في مخفف المعايرة إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 9. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2، ولكن مع 5 غسلات إجمالاً. ١٠. أضف ١٠٠ ميكرولتر من كاشف الإنزيم المخفف في مخفف الفحص إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١١. اسحب/اغسل كما في الخطوة ٢، ولكن مع ٧ غسلات إجمالاً. ملاحظة: في خطوة الغسل الأخيرة هذه، انقع الآبار في محلول الغسل لمدة ٣٠ ثانية إلى دقيقة واحدة لكل غسلة. ١٢. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١٣. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. ١٤. اقرأ الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر في غضون ٣٠ دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، فاطرح الامتصاص عند ٥٧٠ نانومتر من الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر. ملخص إجراء الفحص ١. أضف ١٠٠ ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. 1. حضّن العينات طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية. 2. اسحب المحلول واغسلها 3 مرات. 3. في أطباق الحجب: ضع 200 ميكرولتر من مخفف الفحص في كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 4. اسحب المحلول واغسلها 3 مرات. 5. أضف 100 ميكرولتر من المحلول القياسي أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 6. اسحب المحلول واغسلها 5 مرات. 7. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف المخفف إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 8. اسحب المحلول واغسلها 5 مرات. 9. أضف 100 ميكرولتر من SAv-HRP المخفف إلى كل بئر. حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 10. اسحب المحلول واغسلها 7 مرات (مع نقع لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة). 11. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة مع تصحيح الطول الموجي عند 570 نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل منها. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع تركيز IgG2a على المحور السيني والامتصاص على المحور الصادي. ارسم منحنى أفضل مطابقة يمر بنقاط المعيار. لتحديد تركيز IgG2a للعينات المجهولة، أوجد متوسط ​​قيمة امتصاص العينة المجهولة على المحور الصادي وارسم خطًا أفقيًا إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا إلى المحور السيني واقرأ تركيز IgG2a. إذا كانت العينات مخففة، اضرب تركيز IgG2a في عامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام معالجة البيانات الحاسوبية، باستخدام تحليل الانحدار اللوغاريتمي. التفاعل المتبادل النوعي: تم اختبار الغلوبولينات المناعية التالية بتركيز ≥ 10 ميكروغرام/مل للكشف عن التفاعل المتبادل المحتمل في مجموعة BD OptEIA™ IgG2a ELISA للفئران. لم يتم رصد أي تفاعلات متبادلة ذات دلالة إحصائية (قيم ≥ 3.1 نانوغرام/مل). الجلوبيولين المناعي للفئران: IgG1 (κ)، IgG1 (κ)، IgG2b (κ)، IgG2b (κ)، IgG3 (κ)، IgG3 (κ)، IgM (κ)، IgM (κ)، IgA (κ)، IgA (κ)، IgA (κ)، IgE (κ) تم اختبار عينات مصل IgG2a (κ)، IgG2b (κ)، IgG2b (κ)، IgG2c (κ)، IgM (κ)، IgM (κ)، IgA (κ)، IgE (κ) من أنواع مختلفة من الفئران (BALB/c، NZB، NZBWF1، وBXSB)، المحصنة أو غير المحصنة، في هذا الاختبار. تراوحت تركيزات IgG2a المقاسة بين 0.16 ملغم/مل و5.46 ملغم/مل. لم يُعثر على أي IgG2a قابل للكشف في مصل فئران SCID (RAG-/-). أنماط الغلوبولين المناعي: يجب على الباحثين الانتباه إلى احتمال وجود اختلافات طفيفة في قياسات مستويات IgG2a بين الأنواع المختلفة و/أو الأنماط المناعية. من المعروف أن مجموعة BD OptEIA™ IgG2a للفئران لها تقارب مختلف لـ IgG2a من فئران النمط المناعي b مقارنةً بالنمط المناعي a. فهي تتعرف على IgG2a من النمط المناعي a بشكل أفضل بحوالي 8.1 مرة من IgG2a من النمط المناعي b. ولأن هذا الاختبار يستخدم جسمًا مضادًا أحادي النسيلة IgG2a نقيًا من النمط المناعي a كمعيار، فينبغي استخدام معامل تحويل 8.1 لتحديد كمية IgG2a من النمط المناعي b. على سبيل المثال، تم اختبار مجموعة من عينات مصل فئران C57BL/6 (النمط الجيني b) باستخدام هذا الاختبار، وأظهرت نطاق تركيز يتراوح بين 1.04 و7.84 ميكروغرام/مل، بينما يجب أن يكون النطاق الفعلي بين 8.4 و63.5 ميكروغرام/مل بعد التحويل. محددات الإجراء: • يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مخفف المعايرة القياسي وإعادة اختبارها. • لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الدواء أو المستقبلات الذائبة أو البروتينات الرابطة الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. • مجموعات BD OptEIA™ مُصممة للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات NCCLS لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر