BD، 553481، معيار BD Pharmingen™ IgE الفأري النقي، النمط المتساوي κ

الاسم البديل: دانسيل؛ DNS؛ 5-[ثنائي ميثيل أمينو] نفثالين-1-سلفونيل
النمط المصلي: IgE الفأري C.SW، κ
التطبيق: معيار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_10050441
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب. يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
إجراءات الفحص الموصى بها: يُعد المستنسخ 27-74 مفيدًا كمعيار في فحص ELISA. يُرجى الرجوع إلى بروتوكول فحص ELISA للغلوبولين المناعي E للفأر أدناه. بروتوكول فحص ELISA للغلوبولين المناعي E للفأر: التغطية بالأجسام المضادة المُثبِّتة: 1. خفف الجسم المضاد أحادي النسيلة المُثبِّت للغلوبولين المناعي E للفأر (رقم المنتج 553413، المستنسخ R35-72) إلى 2 ميكروغرام/مل في محلول التغطية.* أضف 100 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة ELISA مُحسَّنة لربط البروتين (مثل صفائح BD Falcon™ ELISA، BD Labware رقم المنتج 353279). 2. رج الصفيحة جيدًا للتأكد من تغطية جميع الآبار بمحلول الأجسام المضادة المُثبِّتة. 3. غطِّ الصفيحة واحضنها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. 4. اغسل الصفيحة 3 مرات بمحلول PBS/Tween*. لكل غسلة، تُملأ الآبار بـ 200 ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي/توين وتُترك لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل الشفط أو التخلص من المحلول. كخطوة أخيرة، تُربت الصفيحة على مناديل ورقية لإزالة المحلول الزائد. الحجب: 1. تُحجب الصفيحة بـ 200 ميكرولتر من محلول الحجب* لكل بئر. 2. تُغطى الصفيحة وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. 3. تُغسل الصفيحة 3 مرات بمحلول الفوسفات الملحي/توين، كما في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. تطبيق المعايير والعينات: 1. يُترك العمود 1 كآبار فارغة (أي، بدون إضافة مستضد، 100 ميكرولتر من محلول الحجب فقط لكل بئر). استخدم العمودين 2 و3 لعينات مكررة من المعيار، 100 ميكرولتر لكل بئر: خفف معيار IgE الفأري النقي (رقم المنتج 557079، المستنسخ C38-2؛ أو رقم المنتج 553481، المستنسخ 27-74) أو معيار IgE الفأري (رقم المنتج 557080، المستنسخ C48-2) في سلسلة من 8 تخفيفات ثنائية، في محلول الحجب، بدءًا من 0.5 ميكروغرام/مل. استخدم الأعمدة المتبقية لإضافة عينات بتخفيفات مختلفة في محلول الحجب، 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. غطِ الصفيحة واحتضنها لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. 3. اغسل الصفيحة 3 مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. التحضين باستخدام الأجسام المضادة للكشف: 1. خفف الأجسام المضادة IgE المضادة للفأر والموسومة بالبيوتين (رقم المنتج 553419، المستنسخ R35-118) إلى تركيز 2 ميكروغرام/مل في محلول الحجب. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. غطِ الصفيحة وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 3. اغسل الصفيحة 6 مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. إضافة أفيدين- أو ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (Av-HRP أو SAv-HRP): 1. خفف Av-HRP (رقم المنتج 554058) أو SAv-HRP (رقم المنتج 554066) بنسبة 1:1000 في محلول الحجب. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. غطِ الصفيحة وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. 3. اغسل الصفيحة 6 مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. أضف الركيزة وقم بالتطوير: 1. قم بإذابة محلول الركيزة (ABTS)* خلال 20 دقيقة من الاستخدام. أضف 11 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين 30% (سيجما، رقم المنتج H1009) إلى 11 مل من محلول الركيزة وقم بالخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر على الفور واتركه ليتطور في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. يمكن إيقاف تفاعل اللون بإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من محلول SDS/DMF* (اختياري). 2. اقرأ الصفيحة عند 405 نانومتر. *المحاليل* محلول التغطية، محلول الركيزة، محلول الركيزة، محلول الركيزة، محلول الركيزة، محلول الركيزة، محلول الركيزة، محلول الركيزة، الرقم الهيدروجيني 7.2 - 7.4، محلول الركيزة، ABTS (حمض 3-إيثيل بنزوثيازولين-6-سلفونيك، سيجما، رقم المنتج A-1888) 150 ملغ، توين-20 0.05%، حمض الستريك 0.1 مولار (مثل، فيشر اللامائي، رقم المنتج A-940) 500 مل، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.35 باستخدام حبيبات هيدروكسيد الصوديوم، قسّم المحلول إلى حصص بحجم 11 مل لكل قارورة، وخزّنه في درجة حرارة -20 درجة مئوية، محلول الركيزة، محلول الحجب، كلوريد الصوديوم 80.0 غ، محلول الركيزة، فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدروجين 11.6 غ، مصل العجل الجنيني 10%، محلول SDS/DMF، فوسفات البوتاسيوم أحادي الهيدروجين 2.0 غ أو ألبومين المصل البقري 1%، SDS 40% (80 غ SDS في 200 مل من الماء المقطر)، كلوريد البوتاسيوم 2.0 غ، أضف 200 مل من ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) مخفف بالماء المقطر حتى 10 لترات. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 - 7.4. ملاحظات: أ. في معظم الحالات، يؤدي تغطية الصفيحة بالأجسام المضادة الأولية بتركيز 2 ميكروغرام/مل، 100 ميكرولتر لكل بئر، والكشف باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المبيوتينية بتركيز 2 ميكروغرام/مل، 100 ميكرولتر لكل بئر، إلى إشارة مرضية للغاية. مع ذلك، للحصول على إشارة مثالية، ينبغي على الباحثين معايرة كل جسم مضاد على مدى نطاق من التركيزات (مثلًا، 1 - 8 ميكروغرام/مل). ب. ظروف الحضانة الموصى بها للحصول على حساسية مثالية. ج. يمكن استبدال مُقترن الستربتافيدين/أفيدين-HRP من مورد آخر وتخفيفه وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. يجب تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يُعد أزيد الصوديوم مثبطًا عكسيًا لعملية الأيض التأكسدي؛ لذلك، يجب عدم استخدام مستحضرات الأجسام المضادة التي تحتوي على هذه المادة الحافظة في مزارع الخلايا أو حقنها في الحيوانات. يمكن إزالة أزيد الصوديوم عن طريق غسل الخلايا المصبوغة أو الأجسام المضادة المرتبطة بالصفيحة أو عن طريق غسيل الأجسام المضادة الذائبة في محلول منظم خالٍ من أزيد الصوديوم. نظرًا لأن السموم الداخلية قد تؤثر أيضًا على نتائج الدراسات الوظيفية، فإننا نوصي باستخدام صيغة الأجسام المضادة NA/LE (خالية من الأزيد/منخفضة السموم الداخلية)، إن وجدت، للاستخدام في المختبر وفي الجسم الحي.