BD، 555142، مجموعة BD OptEIA™ ELISA للإنترفيرون غاما البشري

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869029
الوصف: المواد المُقدمة: تحتوي مجموعة BD OptEIA™ للإنترفيرون غاما البشري (IFN-γ) على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للإنترفيرون غاما البشري الطبيعي أو المُعاد تركيبه في المصل والبلازما وسوائل مزارع الخلايا. تُوفر مواد كافية لتحضير ما يقارب 20 صفيحة من 96 بئرًا، وذلك باتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموصى بها والمحددة في هذه العبوة. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA™ تصميمًا مرنًا للفحص ليناسب احتياجات كل مختبر على حدة. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: الالتقاط، الكشف، معايرة الأجسام المضادة، وقت الحضانة، درجة حرارة الحضانة، تركيبة مخفف الفحص، درجة حموضة المحلول المنظم، القوة الأيونية، تركيز البروتين، نوع الركيزة، تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع). المعايرة: تمت معايرة هذا الفحص المناعي باستخدام إنترفيرون غاما بشري مُعاد التركيب مُنقّى، مُنتَج في شركة BD Biosciences Pharmingen، ومُعبَّر عنه بواسطة فيروسات باكولوفيروسية. وقد تم تقييم المعيار البريطاني الأول NIBSC/WHO رقم 82/587 (إنترفيرون غاما بشري مُحضَّر بتحفيز الفيتوهيماغلوتينين) في هذه المجموعة. معامل التحويل لمادة NIBSC هو كما يلي: القيمة المكافئة لـ NIBSC (وحدة دولية/مل) = 0.010 × إنترفيرون غاما بشري BD OptEIA™ (بيكوغرام/مل). كما تم تقييم معيار NIAID رقم Gxg01-902-535 (إنترفيرون غاما بشري مُعاد التركيب مُعبَّر عنه في بكتيريا الإشريكية القولونية) في هذه المجموعة. معامل التحويل لمواد NIAID هو كما يلي: القيمة المكافئة لـ NIAID (وحدة دولية/مل) = 0.021 × قيمة BD OptEIA™ IFN-γ (بيكوغرام/مل).
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA™ B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف التحليل، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية - كربونات الصوديوم 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ 8.40 غرام من بيكربونات الصوديوم، 3.56 غرام من كربونات الصوديوم؛ يُكمل الحجم إلى 1.0 لتر؛ درجة الحموضة إلى 9.5. يُحضّر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف التحليل - محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة حتى 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُعطَّل بالحرارة). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول الغسل - محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات* مع 0.05% توين-20. يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 4. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يوصى باستخدام مجموعة كواشف BD Pharmingen™ TMB Substrate Reagent Set (رقم المنتج 555214). 5. محلول الإيقاف - 1 مولار H3PO4 أو 2 مولار H2SO4. المواد الإضافية المطلوبة: 1. يوصى باستخدام صفائح BD Falcon™ ELISA ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح دقيقة قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة آلية للبيانات. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو غشاء بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. السائل الطافي لمزارع الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل، واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ 20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. البلازما: اجمع البلازما باستخدام السترات أو EDTA أو الهيبارين كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g خلال 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة < -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد تسخين المعيار المجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المحلول القياسي المجفف بالتجميد بإضافة 1.0 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول قياسي مركز. اترك المحلول القياسي حتى يصل إلى حالة التوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: بعد إعادة التكوين، قسّم المحلول القياسي المركز فورًا إلى أجزاء متساوية في قوارير بولي بروبيلين، 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّنها عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمها إلى أجزاء متساوية وتجميدها. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة. 3. تحضير المحاليل القياسية للتحليل: أ. حضّر محلولًا قياسيًا بتركيز 300 بيكوغرام/مل من المحلول القياسي المركز. رجّ المحلول جيدًا باستخدام جهاز الرجّ. (راجع تعليمات التخفيف في شهادة التعليمات/التحليل). ب. أضف 300 ميكرولتر من مخفف التحليل إلى 6 أنابيب. قم بتسمية العينات بالتركيزات التالية: 150 بيكوغرام/مل، 75 بيكوغرام/مل، 37.5 بيكوغرام/مل، 18.8 بيكوغرام/مل، 9.4 بيكوغرام/مل، و4.7 بيكوغرام/مل. ج. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة بإضافة 300 ميكرولتر من كل معيار إلى الأنبوب التالي مع الخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي بين كل عملية نقل. يُستخدم مخفف المعايرة كمعيار صفري (0 بيكوغرام/مل). إجراء المعايرة بالتفصيل: 1. قم بتغطية الآبار الدقيقة بـ 100 ميكرولتر لكل بئر من الأجسام المضادة المُلتقطة المخففة في محلول التغطية. للاطلاع على التخفيف الموصى به لتغطية الأجسام المضادة، راجع التعليمات/شهادة التحليل الخاصة بالدفعة. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. 2. اسحب المحلول من الآبار واغسلها 3 مرات باستخدام 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة وجففها بورق ماص لإزالة أي محلول متبقٍ. 3. قم بتغطية الصفائح بـ 200 ميكرولتر أو أكثر من مخفف المعايرة لكل بئر. حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 4. اسحب المحلول واغسل الصفائح كما في الخطوة 2. 5. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف المعايرة. راجع قسم "تحضير المعايير والتعامل معها". 6. ضع 100 ميكرولتر من كل معيار وعينة وعينة تحكم في الآبار المناسبة باستخدام ماصة. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 7. اسحب المحلول واغسل الصفائح كما في الخطوة 2، ولكن مع 5 غسلات إجمالاً. 8. أضف 100 ميكرولتر من كاشف العمل (جسم مضاد للكشف + كاشف SAv-HRP) إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 9. اسحب المحلول واغسل الصفائح كما في الخطوة 2، ولكن مع 7 غسلات إجمالاً. ملاحظة: في خطوة الغسل الأخيرة هذه، انقع الآبار في محلول الغسل لمدة تتراوح بين 30 ثانية ودقيقة واحدة لكل غسلة. ١٠. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١١. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. ١٢. اقرأ الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر خلال ٣٠ دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، اطرح الامتصاص عند ٥٧٠ نانومتر من الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر. ملخص إجراء الفحص: ١. أضف ١٠٠ ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. حضّن طوال الليل عند ٤ درجات مئوية. ٢. اسحب المحلول واغسل ٣ مرات. ٣. صفائح الحجب: أضف ٢٠٠ ميكرولتر من مخفف الفحص إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ٤. اسحب المحلول واغسل ٣ مرات. ٥. أضف ١٠٠ ميكرولتر من المعيار أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ٦. اسحب المحلول واغسله ٥ مرات. ٧. أضف ١٠٠ ميكرولتر من كاشف العمل (الأجسام المضادة للكشف + SAv-HRP) إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ٨. اسحب المحلول واغسله ٧ مرات (مع نقع لمدة ٣٠ ثانية إلى دقيقة واحدة). ٩. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١٠. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند ٤٥٠ نانومتر خلال ٣٠ دقيقة مع تصحيح الطول الموجي عند ٥٧٠ نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل منها. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع تركيز IFN-γ على المحور السيني والامتصاص على المحور الصادي. ارسم منحنى أفضل مطابقة يمر بنقاط المعايرة. لتحديد تركيز الإنترفيرون غاما (IFN-γ) في العينات المجهولة، ابحث عن متوسط ​​قيمة الامتصاص للعينة على المحور الصادي، وارسم خطًا أفقيًا يصل إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا يصل إلى المحور السيني، واقرأ تركيز الإنترفيرون غاما. في حال تخفيف العينات، اضرب تركيز الإنترفيرون غاما بمعامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام تحليل الانحدار اللوغاريتمي (log-log) لتقليل البيانات باستخدام الحاسوب. الخصوصية والتفاعل المتبادل: تم اختبار العوامل التالية في اختبار BD OptEIA™ عند تركيز ≥ 10 نانوغرام/مل، ولم يُرصد أي تفاعل متبادل. الإنسان المؤتلف: IL-1α، IL-1β، IL-2، IL-3، IL-4، IL-5، IL-6، IL-7، IL-8، IL-9، IL-10، IL-11، IL-12 (p40)، IL-12 (p70)، IL-13، IL-15، G-CSF، GM-CSF، CD23، Lymphotactin، MIP-1α، MIP-1β، MCP-1، MCP-2، NT-3، PDGF-AA، SCF، TNF، LT-α (TNF-β) VEGF Recombinant Mouse: IL-1β، IL-2، IL-3، IL-4، IL-5، IL-6، IL-7، IL-9، IL-10، IL-12 (ص70)، IL-15، IFN-γ، GM-CSF، MCP-1، TCA3، TNF (فئران مُعاد تركيبها): IL-2، IL-4، IL-6، IL-10، GM-CSF، IFN-γ، TNF. مواد أخرى: IL-10 الفيروسي (1 نانوغرام/مل). TNF (أرانب). المواد المتداخلة: أُضيفت المواد التالية بتركيزات 2 ملغ/مل أو أعلى إلى مُخفف الفحص المُضاف إليه 200 بيكوغرام/مل من IFNγ. لم يُلاحظ أي تأثير على نتائج الفحص. البيليروبين، غاما غلوبولين بشري، هيموغلوبين بشري، ألبومين مصل بشري، ترانسفيرين بشري، ثلاثي الغليسريد، هيبارين (300 وحدة/مل)، سترات الصوديوم، EDTA. قيود الإجراء: يجب تخفيف العينات التي تُنتج قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة فحصها. لم يتم التحقق بدقة من تداخل نواتج أيض الدواء، أو المستقبلات الذائبة، أو البروتينات الرابطة الأخرى في العينات. ولا يمكن استبعاد احتمال حدوث هذا التداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات NCCLS لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر