BD، 556003، BD Pharmingen™ مضاد Ki-67 نقي من الفئران

الاسم البديل: MKI67؛ تم تحديد المستضد بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة Ki-67؛ KIA
التفاعل: الإنسان (اختبار مراقبة الجودة)، الفأر (تم اختباره أثناء التطوير)، الجرذ، قرد الريسوس (تم الإبلاغ عنه)
النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
المستضد: كي-67 البشري
التطبيقات: التصوير الحيوي، التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)، لطخة ويسترن (غير موصى به)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_396287
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب.
إجراءات التحليل الموصى بها: بروتوكول التلوين لتقنية قياس التدفق الخلوي: 1. اجمع الخلايا، وعدها، وترسيبها باتباع الإجراءات القياسية (ملاحظة: يُعبر عن Ki-67 بواسطة الخلايا المتكاثرة. قد لا يظهر أي تلوين مع الخلايا غير المحفزة، مثل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة غير المحفزة). 2. أثناء عملية الطرد المركزي، أضف 5 مل من الإيثانول البارد بتركيز 70-80% قطرة قطرة إلى راسب الخلايا (1-5 × 10^7 خلية). ثم حضّنها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. يمكن استخدام هذه الخلايا المثبتة لمدة تصل إلى 60 يومًا بعد التثبيت (تُحفظ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية). 3. أضف 30-40 مل من محلول الغسل (محلول ملحي فوسفاتي مع 1% مصل بقري جنيني، 0.09% أزيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.2) إلى الخلايا المثبتة. قم بطرد الخلايا مركزيًا لمدة 10 دقائق عند 1000 دورة في الدقيقة، ثم اسحب السائل الطافي. اغسل مرة أخرى باستخدام 30-40 مل من محلول الغسل. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي. 4. أعد تعليق الخلايا بتركيز 1 × 10⁷ خلية/مل (1 × 10⁶ خلية/100 ميكرولتر). 5. انقل 100 ميكرولتر من معلق الخلايا إلى كل أنبوب جديد. 6. أضف 20 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف بشكل صحيح وفقًا للبروتوكول إلى الأنابيب المذكورة أعلاه. اخلط برفق. 7. حضّن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة في الظلام. 8. اغسل باستخدام 2 مل من محلول الغسل PBS بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. 9. تخلص من السائل الطافي. ١٠. بالنسبة للأجسام المضادة المقترنة مباشرة: انتقل إلى الخطوتين ١٣ و١٤. ١١. بالنسبة للأجسام المضادة المنقاة: أضف ٥٠ ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف بالتركيز الأمثل (رقم المنتج ٥٥٥٩٨٨)، وحضّنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة في الظلام. ١٢. كرر الخطوتين ٨ و٩. ١٣. أضف ٠.٥ مل من محلول غسيل PBS إلى كل أنبوب. بالنسبة للأجسام المضادة المقترنة بـ FITC، أضف ميكرولتر من محلول تلوين PI (رقم المنتج ٥٥٦٤٦٣)؛ بالنسبة للأجسام المضادة المقترنة بـ PE، أضف ٢٠ ميكرولتر من محلول BD Via-Probe™ لقياس حيوية الخلايا (رقم المنتج ٥٥٥٨١٦) إلى كل أنبوب. ١٤. حلل العينة باستخدام FACS. بروتوكول التلوين للتصوير الحيوي: إجراء الميثانول للوحة ٩٦ بئراً: أزل الوسط من الآبار. أضف 100 ميكرولتر/بئر من محلول الفورمالديهايد الطازج بتركيز 3.7% في محلول الفوسفات الملحي (PBS). حضّن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول وأضف 100 ميكرولتر/بئر من محلول الميثانول بتركيز 90%. حضّن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول واغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). تخلص من محلول الفوسفات الملحي (PBS) وأضف 100 ميكرولتر/بئر من محلول الحجب (3% مصل بقري جنيني في محلول الفوسفات الملحي (PBS)). حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول وأضف الجسم المضاد المخفف (المخفف في محلول الحجب). حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). تخلص من محلول الفوسفات الملحي (PBS) وأضف كاشف الخطوة الثانية. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). صوّر العينة. إجراء Triton-X 100 للوحة 96 بئراً: أزل الوسط من الآبار. أضف 100 ميكرولتر/بئر من محلول الفورمالديهايد الطازج بتركيز 3.7% في محلول الفوسفات الملحي (PBS). حضّن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول وأضف 100 ميكرولتر/بئر من محلول تريتون X-100 بتركيز 0.1%. حضّن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول واغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). تخلص من محلول الفوسفات الملحي (PBS) وأضف 100 ميكرولتر/بئر من محلول الحجب (3% مصل بقري جنيني في محلول الفوسفات الملحي). حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول وأضف الجسم المضاد المخفف (المخفف في محلول الحجب). حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول واغسل ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). تخلص من المحلول وأضف كاشف الخطوة الثانية. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول واغسل ثلاث مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). صوّر العينة.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يجب استخدام عنصر تحكم من نفس النوع بنفس تركيز الجسم المضاد المطلوب. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تم تطوير هذا الجسم المضاد واعتماده لتطبيقات التصوير الحيوي. مع ذلك، لا يُجرى اختبار التصوير الحيوي الروتيني على كل دفعة. يُنصح الباحثون بمعايرة الكاشف للحصول على أفضل أداء. قد لا يكون التفاعل المتبادل بين الأنواع الذي تم اكتشافه أثناء تطوير المنتج قد تم تأكيده في كل شكل و/أو تطبيق. أزيد الصوديوم مثبط عكسي لعملية الأيض التأكسدي؛ لذلك، يجب عدم استخدام مستحضرات الأجسام المضادة التي تحتوي على هذه المادة الحافظة في مزارع الخلايا أو حقنها في الحيوانات. يمكن إزالة أزيد الصوديوم عن طريق غسل الخلايا المصبوغة أو الجسم المضاد المرتبط بالصفيحة أو عن طريق غسيل الجسم المضاد القابل للذوبان في محلول منظم خالٍ من أزيد الصوديوم. بما أن السموم الداخلية قد تؤثر أيضًا على نتائج الدراسات الوظيفية، فإننا نوصي باستخدام الأجسام المضادة من نوع NA/LE (خالية من الأزيد/منخفضة السموم الداخلية)، إن توفرت، للاستخدام في المختبر وفي الجسم الحي. تريتون علامة تجارية مسجلة لشركة داو كيميكال. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com/us/s/resources.