BD، 556381، مجموعة BD Pharmingen™ APO-DIRECT™

التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869067
الوصف: تُعدّ عملية تفتيت الحمض النووي (DNA) إحدى الخطوات الأخيرة في موت الخلايا المبرمج، وهي عملية تنتج عن تنشيط الإنزيمات النووية الداخلية أثناء برنامج موت الخلايا المبرمج. تعمل هذه الإنزيمات على تحليل بنية الكروماتين عالية الترتيب إلى شظايا يبلغ طولها حوالي 300 كيلوبايت، ثم إلى قطع أصغر من الحمض النووي يبلغ طولها حوالي 50 زوجًا قاعديًا. تعتمد إحدى الطرق الشائعة للكشف عن الحمض النووي المتفتت على تفاعل يحفزه إنزيم TdT خارجي، ويُشار إليه غالبًا باسم "الوسم الطرفي" أو "TUNEL" (وسم نهايات الحمض النووي المكسورة باستخدام dUTP بواسطة إنزيم ناقل النيوكليوتيد الطرفي). يُعدّ اختبار APO-DIRECT™ (رقم المنتج 6536KK) طريقة أحادية الخطوة لوسم فواصل الحمض النووي باستخدام FITC-dUTP، يليها تحليل بالتدفق الخلوي. في اختبار APO-BRDU™، يحفز إنزيم TdT إضافةً مستقلةً عن القالب لثلاثي فوسفات ديوكسي يوريدين المُبروم (Br-dUTP) إلى نهايات 3'-هيدروكسيل (OH) للحمض النووي المزدوج والمفرد. بعد الإضافة، تُحدد هذه المواقع باستخدام قياس التدفق الخلوي عن طريق تلوين الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ BrdU موسوم بـ FITC. APO-DIRECT™ هي طريقة تلوين أحادية الخطوة لتحديد فواصل الحمض النووي للكشف عن الخلايا الميتة المبرمجة باستخدام قياس التدفق الخلوي. تتوفر كمية كافية من الكواشف لإجراء 50 اختبارًا. تحتوي المجموعة على 5 مل من معلقات الخلايا الموجبة و5 مل من معلقات الخلايا السالبة، أي ما يقارب 1 × 10^6 خلية لكل مل في 70% (حجم/حجم) من الإيثانول. الخلايا الضابطة مشتقة من سلالة خلايا ليمفوما بشرية، وقد تم تثبيتها كما هو موضح أدناه في بروتوكول التثبيت. تتكون مجموعة APO-DIRECT™ من جزأين (الجزء أ والجزء ب). يتكون الجزء أ (رقم المنتج 51-6536AK) من: زجاجة واحدة سعة 25 مل من محلول التلوين PI/RNase (5 ميكروغرام/مل، 200 ميكروغرام/مل RNase) [رقم المنتج 51-6551AZ]، وقارورة واحدة سعة 0.5 مل من محلول التفاعل (يحتوي على حمض الكاكوديليك (ثنائي ميثيل الزرنيخ)) [رقم المنتج 51-6549AZ]، وزجاجة واحدة سعة 100 مل من محلول الشطف (يحتوي على 0.05% أزيد الصوديوم) [رقم المنتج 51-6550AZ]، وزجاجة واحدة سعة 100 مل من محلول الغسيل (يحتوي على 0.05% أزيد الصوديوم) [رقم المنتج 51-6548AZ]. يتكون الجزء ب (رقم المنتج 51-6536BK) من: زجاجة واحدة سعة 0.4 مل من FITC-dUTP (0.25 نانومول) [رقم المنتج 51-6555EZ] زجاجة واحدة سعة 5 مل من خلايا التحكم السلبية [تحتوي على 70% (حجم/حجم) من الإيثانول] [رقم المنتج 51-6553LZ] زجاجة واحدة سعة 5 مل من خلايا التحكم الإيجابية [تحتوي على 70% (حجم/حجم) من الإيثانول] [رقم المنتج 51-6552LZ] زجاجة واحدة سعة 0.038 مل من إنزيم TdT [200 ميكروغرام/مل (SA= 100,000 وحدة/ملغ) في محلول جلسرين 50% (حجم/حجم)؛ لا يتجمد عند -20 درجة مئوية] [رقم المنتج 51-6554EZ].
التحضير والتخزين: تتكون مجموعة APO-DIRECT™ من جزأين (أ و ب). يُشحن الجزء أ (رقم المنتج 51-6536AK) في درجة حرارة الغرفة، ويجب تخزينه عند 4 درجات مئوية فور وصوله. أما الجزء ب (رقم المنتج 51-6536BK) فيُشحن عند -80 درجة مئوية على ثلج جاف، ويجب تخزينه عند -20 درجة مئوية فور وصوله. وقد أكدت شركة BD Biosciences Pharmingen أن طريقة الشحن هذه كافية للحفاظ على سلامة مكونات المجموعة.
إجراءات الفحص الموصى بها: طرق تثبيت وتلوين وتحليل عينات APO-DIRECT™ بروتوكول التثبيت: هذا بروتوكول قياسي يُستخدم في BD Biosciences Pharmingen لاختبار مراقبة جودة مجموعة APO-DIRECT™. يُعد تثبيت الخلايا باستخدام البارافورمالدهيد خطوة أساسية في فحص APO-DIRECT™. إجراء تثبيت الخلايا التالي هو طريقة مقترحة. قد تؤثر متغيرات مثل مصدر الخلايا وظروف النمو على النتائج. يجب اعتبار ظروف التثبيت المذكورة أدناه بمثابة إرشادات. قد يلزم إجراء تجارب إضافية للحصول على نتائج مماثلة لخلايا التحكم المرفقة بهذه المجموعة. خلايا التحكم الموجبة والسالبة المرفقة في مجموعة APO-DIRECT™ مثبتة مسبقًا. 1. تُعلق الخلايا في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 1% (وزن/حجم) في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) (الأس الهيدروجيني 7.4) بتركيز 1-2 × 10^6 خلية/مل. ٢. ضع معلق الخلايا على الثلج لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة. ٣. افصل الخلايا بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٣٠٠ × جم، ثم تخلص من السائل الطافي. ٤. اغسل الخلايا في ٥ مل من محلول الفوسفات الملحي (PBS)، ثم افصلها بالطرد المركزي. كرر عملية الغسل والطرد المركزي. ٥. أعد تعليق الخلايا في محلول الفوسفات الملحي المتبقي في الأنبوب عن طريق رج الأنبوب برفق. ٦. اضبط تركيز الخلايا إلى ١-٢ × ١٠^٦ خلية/مل في إيثانول بارد بنسبة ٧٠٪ (حجم/حجم). اترك الخلايا لمدة ٣٠ دقيقة على الأقل على الثلج أو في المجمد. انظر الملاحظة أدناه. ٧. خزّن الخلايا في إيثانول بنسبة ٧٠٪ (حجم/حجم) عند درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية حتى الاستخدام. يمكن تخزين الخلايا عند درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية لعدة أيام قبل الاستخدام. ملاحظة: في بعض الأنظمة البيولوجية، يُعطي تخزين الخلايا عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول إيثانول بتركيز 70% (حجم/حجم) لمدة 12-18 ساعة على الأقل قبل تلوينها للكشف عن موت الخلايا المبرمج أفضل النتائج. يمكن تخزين الخلايا عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أشهر قبل استخدامها. بروتوكول التلوين: يصف البروتوكول التالي طريقة قياس موت الخلايا المبرمج في خلايا التحكم الموجبة والسالبة المتوفرة في مجموعة APO-DIRECT™. يجب اتباع الإجراء نفسه لقياس موت الخلايا المبرمج في عينات الخلايا التي يقدمها الباحث. 1. أعد تعليق خلايا التحكم الموجبة (51-6552LZ) والسالبة (51-6553LZ) عن طريق تحريك الأنابيب. خذ 1 مل من معلقات خلايا التحكم (حوالي 1 × 10^6 خلية/مل) وضعها في أنابيب طرد مركزي 12 × 75 مم. قم بتدوير معلقات الخلايا الضابطة لمدة 5 دقائق عند 300 × g، ثم أزل الإيثانول بتركيز 70% (حجم/حجم) بالشفط، مع الحرص على عدم تحريك الخلايا المترسبة. 2. أعد تعليق كل أنبوب من الخلايا الضابطة في 1.0 مل من محلول الغسل (51-6548AZ) لكل أنبوب. قم بالتدوير كما في السابق، ثم أزل السائل الطافي بالشفط. 3. كرر معالجة محلول الغسل (الخطوة 2). 4. أعد تعليق كل أنبوب من كريات الخلايا الضابطة في 50 ميكرولتر من محلول وسم الحمض النووي (المُحضر كما هو موضح أدناه). لإجراء اختبار واحد، استخدم الكميات التالية من محاليل وسم الحمض النووي: محلول وسم الحمض النووي، اختبار واحد، 6 اختبارات، 12 اختبارًا، محلول التفاعل (غطاء أخضر) 10.00 ميكرولتر، 60.00 ميكرولتر، 120.00 ميكرولتر، إنزيم TdT (غطاء أصفر) 0.75 ميكرولتر، 4.50 ميكرولتر، 9.00 ميكرولتر، FITC dUTP (غطاء برتقالي) 8.00 ميكرولتر، 48.00 ميكرولتر، 96.00 ميكرولتر، ماء مقطر 32.25 ميكرولتر، 193.50 ميكرولتر، 387.00 ميكرولتر، الحجم الكلي 51.00 ميكرولتر، 306.00 ميكرولتر، 612.00 ميكرولتر. 5. حضّن الخلايا في محلول وسم الحمض النووي لمدة 60 دقيقة عند ٣٧ درجة مئوية. يمكن أيضًا إجراء التفاعل في درجة حرارة الغرفة طوال الليل للخلايا الضابطة. بالنسبة لعينات الاختبار، قد يلزم تعديل وقت الحضانة البالغ ٦٠ دقيقة عند ٣٧ درجة مئوية إلى فترات زمنية أطول. ٦. في نهاية وقت الحضانة، أضف ١.٠ مل من محلول الشطف (٥١-٦٥٥٠AZ) إلى كل أنبوب، ثم قم بتدوير كل أنبوب بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × جم لمدة ٥ دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط. ٧. كرر شطف الخلايا باستخدام ١.٠ مل من محلول الشطف، ثم قم بالطرد المركزي، وتخلص من السائل الطافي بالشفط. ٨. أعد تعليق الخلايا المترسبة في ٠.٥ مل من محلول تلوين PI/RNase (٥١-٦٥٥١AZ). ملاحظة: إذا كانت كثافة الخلايا منخفضة، قلل كمية محلول تلوين PI/RNase إلى ٠.٣ مل. ٩. حضّن الخلايا في الظلام لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١٠. حلل الخلايا في محلول PI/RNase باستخدام قياس التدفق الخلوي. ١١. حلل الخلايا في غضون ٣ ساعات من التلوين. قد تبدأ الخلايا بالتلف إذا تُركت طوال الليل قبل التحليل. تحليل عينات APO-DIRECT™ باستخدام قياس التدفق الخلوي: يُجرى هذا الاختبار على جهاز قياس التدفق الخلوي المُجهز بليزر أرجون بطول موجي ٤٨٨ نانومتر كمصدر للضوء. تُظهر الأشكال ١ و٢ النتائج المتوقعة باستخدام خلايا التحكم الموجبة والسالبة. يُستخدم صبغان؛ يصبغ PI الحمض النووي الكلي، بينما يصبغ FITC-dUTP الخلايا الميتة. يتألق PI عند حوالي ٦٢٣ نانومتر، بينما يتألق FITC عند ٥٢٠ نانومتر. يتم إنشاء شاشتين ثنائيتي المعلمات وشاشتين أحاديتي المعلمة باستخدام برنامج جمع بيانات جهاز قياس التدفق الخلوي. يجب أن تكون شاشة عرض البوابات هي شاشة التمييز القياسية ثنائية المعلمات للحمض النووي المزدوج، مع إشارة مساحة الحمض النووي على المحور Y وعرض الحمض النووي على المحور X (الشكل ١). من هذه الشاشة، يتم رسم نطاق حول الخلايا غير المتكتلة، ثم يتم إنشاء شاشة عرض ثانية ثنائية المعلمات. يتمثل الاصطلاح المعتاد في هذه الشاشة في وضع الحمض النووي (التألق الأحمر الخطي) على المحور السيني، وFITCdUTP (التألق الأخضر اللوغاريتمي) على المحور الصادي. يمكن إضافة رسمين بيانيين أحاديي المعلمة، أحدهما للحمض النووي والآخر لـ FITC-dUTP، ولكنهما ليسا ضروريين. باستخدام طريقة العرض ثنائية المعلمات، لا يتم فقط تحديد الخلايا الميتة، بل يتم أيضًا تحديد مرحلة دورة الخلية فيها. نصائح فنية وأسئلة شائعة: 1. بالنسبة للباحثين الذين يستخدمون أنظمة خطوط الخلايا الملتصقة، فإن احتمالية موت الخلايا المبرمج في السائل الطافي أعلى من احتمالية موت الخلايا المبرمج في الخلايا الملتصقة. احتفظ بالخلايا الموجودة في السائل الطافي لاستخدامها في التحليل قبل فصل طبقة الخلايا الملتصقة باستخدام التربسين. ٢. يُعد تثبيت الخلايا باستخدام مُثبِّت كيميائي مُرتبط بالحمض النووي (مثل البارافورمالديهايد) خطوةً مهمةً في تحليل موت الخلايا المبرمج. قد تفقد الخلايا غير المُثبَّتة أجزاءً صغيرةً من الحمض النووي غير المُثبَّت كيميائيًا داخل الخلية قبل خطوات الغسل. قد يحتاج الباحث إلى استكشاف طرق تثبيت ونفاذية بديلة للاستفادة الكاملة من أنظمته. ٣. يُمكن تحضير شريحة سيتوسبين أو شريحة سيتوسبين بالطرد المركزي من عينة APO-DIRECT™ بالطريقة التالية: بعد الانتهاء من تلوين FITC-dUTP، ولكن قبل معالجة PI/RNase، ضع قطرةً من الخلايا المُلوَّنة على شريحة، وقم بتدويرها، ثم افحص العينة تحت مجهر فلوري. ٤. لتقليل فقدان الخلايا أثناء التحليل، نوصي باستخدام أنابيب بوليسترين ١٢ × ٧٥ مم طوال عملية التلوين والتحليل. مع أنواع أخرى من الأنابيب أو المواد البلاستيكية (مثل البولي بروبيلين)، قد تتراكم الخلايا على جدران الأنابيب، مما يؤدي إلى فقدان كبير في عدد الخلايا، بالإضافة إلى عدم كفاءة تلوين الخلايا التي لم تتعرض بشكل كامل لكواشف التلوين. نوصي أيضًا، بعد خطوات الغسل، بإعادة تعليق الخلايا عن طريق الخلط اللطيف وليس باستخدام الماصة، حيث يمكن أن تساهم رؤوس الماصات البلاستيكية أيضًا في فقدان الخلايا خلال التحليل. 5. في بعض الأحيان، تُلاحظ مجموعة من الخلايا ذات كثافة أقل في شاشة العرض ثنائية المعلمات في قياس التدفق الخلوي. تنشأ هذه المجموعة أثناء تفاعل الوسم، عندما تلتصق بعض الخلايا بجدار أنبوب الاختبار ولا تتعرض بشكل كامل لمحلول الوسم. يمكن التغلب على هذه الظاهرة بغسل جميع الخلايا من جدار الأنبوب والتأكد من تعليق جميع الخلايا بشكل صحيح في بداية تفاعل الوسم. 6. إذا لوحظت كثافة منخفضة لتلوين FITC، فحاول زيادة وقت الحضانة أثناء تفاعل تلوين FITC-dUTP. ٧. لا يلزم توفر معلومات عن دورة الخلية، وليس من الضروري إضافة محلول التلوين PI/RNase إلى كل أنبوب. تحذير: يحتوي محلول الغسل (المكون 51-6548AZ) ومحلول التفاعل (المكون 51-6549AZ) على 0.2% من حمض الكاكوديليك (وزن/وزن). بيانات المخاطر: يُشتبه في تسببه بالسرطان. بيانات الاحتياطات: ارتدِ ملابس واقية/واقي للعينين. ارتدِ قفازات واقية. في حالة التعرض أو القلق: احصل على استشارة/رعاية طبية. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية. خطر: تحتوي خلايا التحكم السلبية (المكون 51-6553LZ) وخلايا التحكم الإيجابية (المكون 51-6552LZ) على 56.0% من الإيثانول (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. يسبب تهيجًا خطيرًا للعين. بيانات الاحتياطات: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ قفازات/ملابس واقية/واقي للعينين/واقي للوجه. في حال ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اغسل الجلد بالماء/استحم. في حال ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت وكان من السهل إزالتها. استمر في الشطف. يُحفظ في مكان جيد التهوية. يُحفظ في مكان بارد. أغلق العبوة بإحكام. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية.
تنبيهات المنتج: تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. لذا، يُرجى تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يُرجى مراجعة الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر