BD، 556416، BD Pharmingen™ أنيكسين V المؤتلف النقي

التطبيق: الحجب، قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_2869069
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ المنتج في درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل الاستخدام أو للتخزين طويل الأمد للمحاليل المركزة. تجنب تجميد المنتج وإذابته عدة مرات. تم إنتاج بروتين Annexin V المؤتلف في البكتيريا، ونقاوته ≥95% كما تم تحديده بواسطة SDS/PAGE المصبوغ بصبغة كوميسي الزرقاء.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (Kd ~5 × 10⁻²) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج باستخدام كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام أنيكسين V على خط خلوي (جركات). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج C-9911): 1 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. 2. خلايا جركات تي (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10⁶ خلية جركات. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتباع بروتوكول تلوين أنيكسين V لقياس موت الخلايا المبرمج. تحفيز موت الخلايا المبرمج باستخدام جسم مضاد بشري لـ CD95 (FAS): يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام أنيكسين V على خط خلوي بشري. المواد: 1. خط خلوي أو خلايا أولية يمكن تحفيزها بسهولة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري Fas. ومن الأمثلة على ذلك خلايا ليمفوما داودي (ATCC CCL-213) وخلايا جركات تي (ATCC TIB-152). من المهم ملاحظة أنه قد يكون هناك تباين كبير بين الخطوط الخلوية فيما يتعلق بمستوى الاستماتة التي يمكن تحفيزها من خلال مستقبل Fas. كذلك، ليس بالضرورة أن تخضع جميع أنواع الخلايا التي تُعبر عن مستضد Fas للاستماتة بوساطة Fas. تُعد الخطوط الخلوية المذكورة أعلاه ضوابط إيجابية جيدة لأنها تُحفز بقوة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة Fas. 2. الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لـ CD95 البشري (Fas)، المستنسخ DX2 (رقم المنتج 555670). 3. البروتين G المؤتلف (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج P4689). وجدنا أن إضافة البروتين G إلى وسط زراعة الأنسجة يُحسّن بشكل ملحوظ كفاءة مستنسخ DX2 في تحفيز الاستماتة الخلوية. 4. قوارير زراعة الأنسجة T25. 5. وسط IMDM أو RPMI 1640 مع 10% من مصل الأبقار الجنيني المُعطّل حراريًا (FBS)، و1% من الجلوتامين، و1% من المضادات الحيوية (بنسلين/ستربتومايسين؛ 100 وحدة/مل). يُشار إلى هذا الوسط المُدعّم بـ"الوسط" فيما يلي. الإجراء: 1. حافظ على الخلايا في المزرعة، وغيّر الوسط قبل يوم واحد من تحفيز الاستماتة الخلوية. 2. تحفيز الاستماتة الخلوية: أضف 0.5 - 2 ميكروغرام/مل من الجسم المضاد لـCD95 (مستنسخ DX2) و1-2 ميكروغرام/مل من البروتين G إلى قارورة T25 تحتوي على وسط يحتوي على حوالي 0.5 × 10⁶ خلية/مل. يجب أن تتكون الضوابط السلبية مما يلي: (أ) حوالي 0.5 × 10⁶ خلية/مل مع وسط زراعي فقط (بدون أجسام مضادة أحادية النسيلة أو بروتين G)، و(ب) حوالي 0.5 × 10⁶ خلية/مل مع وسط زراعي و1 ميكروغرام/مل من بروتين G فقط (بدون أجسام مضادة أحادية النسيلة). 3. حضّن الخلايا لمدة تتراوح بين ساعتين و12 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. 4. اتبع بروتوكول تلوين Annexin V لقياس الاستماتة الخلوية. يمكن أيضًا ملاحظة الاستماتة الخلوية باستخدام المجهر الضوئي، أو الرحلان الكهربائي الهلامي (سلالم تجزئة الحمض النووي)، أو باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي القائم على تجزئة الحمض النووي، مثل مجموعة APO-BRDU™ (رقم المنتج 556405) أو مجموعة APO-DIRECT™ (رقم المنتج 556381). بروتوكول تلوين وحجب أنيكسين V: الكواشف: 1. كواشف أنيكسين V المقترنة بالبيوتين (رقم المنتج 556418)، أو FITC (رقم المنتج 556420)، أو PE (رقم المنتج 556422)، أو APC (رقم المنتج 550474)، أو Cy5 (رقم المنتج 559933)، أو Cy5.5 (رقم المنتج 559935): غير مشمولة. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 2. 7-أمينو-أكتينوميسين د (7-AAD): غير مشمولة. 7-AAD (رقم المنتج 559925) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 3. بروبيديوم يوديد (PI): غير مُضمّن. يُعدّ PI (رقم المنتج 556463) صبغةً سهلة الاستخدام للأحماض النووية. استخدم ما يصل إلى 10 ميكرولتر لكل اختبار من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل. قد يختلف التركيز الأمثل لـ PI بين أنواع الخلايا، حيث يُرجّح أن يكون 10 ميكرولتر من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل هو الحد الأقصى المطلوب. قد تُعطي كمية أقل نتائج مثالية في بعض الأنظمة التجريبية. 4. محلول الربط 10X: غير مُضمّن. 0.1 مولار هيبس (الأس الهيدروجيني 7.4)، 1.4 مولار كلوريد الصوديوم، 25 ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يُمكن شراء المنتج برقم المنتج 556454. 5. أنيكسين V المؤتلف المُنقّى (رقم المنتج 556416): مُضمّن. التلوين: 1. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول ربط بتركيز 1 × 10⁶ خلية/مل. 2. انقل 100 ميكرولتر من المحلول (1 × 10⁵ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة 5 مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من أنكسين V المرتبط بصبغة فلورية (لتحليل اللون الواحد أو اللونين) و/أو 5 ميكرولتر من 7-AAD أو 10 ميكرولتر من PI (لتحليل اللونين فقط). 4. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في الظلام. 5. أضف 400 ميكرولتر من محلول الربط إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الخطوة الأولى: حجب الخلايا. 1. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول ربط بتركيز 1 × 10⁶ خلية/مل. 2. انقل 100 ميكرولتر من المحلول (1 × 10⁵ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة 5 مل. 3. أضف 5-15 ميكروغرام من بروتين Annexin V المؤتلف النقي. قد تختلف كمية بروتين Annexin V المؤتلف النقي اللازمة لتشبع مواقع الربط باختلاف نوع الخلية ومرحلة الاستماتة. في بعض الحالات، قد يحتاج الباحثون إلى تقليل عدد الخلايا إلى 0.5 × 10⁵ مع الاستمرار في إضافة 5-15 ميكروغرام من بروتين Annexin V المؤتلف للحصول على أفضل النتائج. يُنصح بشدة بإجراء معايرة. 4. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٥. أضف ٥ ميكرولتر من أنيكسين V المرتبط بالفلوركروم (لتحليل اللون الواحد أو اللونين) و/أو ٥ ميكرولتر من ٧-AAD أو ١٠ ميكرولتر من PI (لتحليل اللونين فقط). ٦. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ٧. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول الربط ١X إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن (خلال ساعة واحدة).
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.