BD، 556418، BD Pharmingen™ بيوتين أنيكسين V

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2869070
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ بيوتين أنيكسين V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (ثابت تفكك Kd يبلغ حوالي 5 × 10⁻²) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط بيوتين أنيكسين V على الكالسيوم، لذا يلزم وجود تركيزات محددة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين بيوتين أنيكسين V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام بيوتين أنيكسين V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل خلايا هيلا، وخلايا NIH 3T3، وما إلى ذلك) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام أنيكسين V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. و van Engelend et al.). تحفيز الاستماتة باستخدام جسم مضاد بشري لـ CD95 (FAS): يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام بيوتين أنيكسين V على خط خلوي بشري. المواد: 1. خط خلوي أو خلايا أولية يمكن تحفيزها بسهولة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري لـ Fas. تشمل الأمثلة خلايا ليمفوما داودي (ATCC CCL-213) وخلايا جركات تي (ATCC TIB-152). من المهم ملاحظة أنه قد يكون هناك تباين كبير بين الخطوط الخلوية فيما يتعلق بمستوى الاستماتة التي يمكن تحفيزها من خلال مستقبل Fas. أيضًا، ليس بالضرورة أن تخضع جميع أنواع الخلايا التي تُعبِّر عن مستضد Fas للاستماتة بوساطة Fas. تُعد الخطوط الخلوية المذكورة أعلاه ضوابط إيجابية جيدة لأنها تُحفَّز بقوة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة لـ Fas. 2. الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري لـ CD95 (Fas)، المستنسخ DX2 (رقم المنتج 555670). 3. بروتين G المؤتلف (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج P4689). وجدنا أن إضافة بروتين G إلى وسط زراعة الأنسجة يُحسّن بشكل ملحوظ كفاءة مستنسخ DX2 في تحفيز الاستماتة الخلوية. 4. قوارير زراعة الأنسجة T25. 5. وسط IMDM أو RPMI 1640 مع 10% من مصل الأبقار الجنيني المُعطّل حراريًا (FBS)، و1% من الجلوتامين، و1% من المضادات الحيوية (بنسلين/ستربتومايسين؛ 100 وحدة/مل). يُشار إلى هذا الوسط المُدعّم ببساطة باسم "الوسط" فيما يلي. الإجراء: 1. حافظ على الخلايا في المزرعة، وغيّر الوسط قبل يوم واحد من تحفيز الاستماتة الخلوية. ٢. تحفيز الاستماتة: أضف ٠٫٥ - ٢ ميكروغرام/مل من الجسم المضاد لـ CD95 (مستنسخ DX2) و١-٢ ميكروغرام/مل من البروتين G إلى قارورة T25 تحتوي على وسط غذائي يحتوي على حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل. يجب أن تتكون الضوابط السلبية مما يلي: (أ) حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل مع الوسط الغذائي فقط (بدون جسم مضاد أحادي النسيلة أو بروتين G)، و(ب) حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل مع الوسط الغذائي و١ ميكروغرام/مل من البروتين G فقط (بدون جسم مضاد أحادي النسيلة). ٣. حضّن الخلايا لمدة ٢ إلى ١٢ ساعة عند ٣٧ درجة مئوية. ٤. تابع بروتوكول تلوين البيوتين أنيكسين V لقياس الاستماتة. يمكن أيضًا ملاحظة موت الخلايا المبرمج (الاستماتة) باستخدام المجهر الضوئي، أو الرحلان الكهربائي الهلامي (سلالم تجزئة الحمض النووي)، أو باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي القائم على تجزئة الحمض النووي، مثل مجموعة APO-BRDU™ (رقم المنتج 556405) أو مجموعة APO-DIRECT™ (رقم المنتج 556381). تحفيز الاستماتة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لبروتين CD95 (FAS) في الفئران: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام بيوتين أنيكسين V على خلايا الفئران. المواد: 1. خط خلوي أو خلايا أولية يمكن تحفيزها بسهولة على الخضوع للاستماتة بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لبروتين Fas في الفئران. يمكن استخدام الخلايا التيموسية المعزولة من فأر BALB/c بعمر 4-6 أسابيع. ٢. جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD95 (Fas) في الفئران، مستنسخ Jo2 (رقم المنتج 554254). ٣. بروتين G مُعاد التركيب (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج P4689). وجدنا أن إضافة بروتين G إلى وسط زراعة الأنسجة يُحسّن بشكل ملحوظ فعالية الجسم المضاد Jo2 في تحفيز الاستماتة الخلوية. ٤. قوارير زراعة الأنسجة T25. ٥. وسط RPMI-1640 مع ١٠٪ من مصل جنين البقر المُعطّل حراريًا (FBS)، و١٪ من الجلوتامين، و١٪ من المضادات الحيوية (بنسلين/ستربتومايسين؛ ١٠٠ وحدة/مل). يُشار إلى هذا الوسط المُدعّم ببساطة باسم "الوسط" فيما يلي. الإجراء: ١. عزل الخلايا التائية من غدة التيموس لفأر من سلالة BALB/c، عمره من ٤ إلى ٦ أسابيع. ٢. تحفيز الاستماتة الخلوية. أضف 2.5-10 ميكروغرام/مل من Jo2 (رقم المنتج 554254) و1-2 ميكروغرام/مل من البروتين G إلى قارورة T25 تحتوي على حوالي 2 × 10⁶ خلية تائية/مل. يجب أن تتكون الضوابط السلبية من: (أ) حوالي 2 × 10⁶ خلية تائية/مل مع وسط زراعي فقط (بدون أجسام مضادة أحادية النسيلة أو بروتين G)، (ب) حوالي 2 × 10⁶ خلية تائية/مل مع وسط زراعي و1-2 ميكروغرام/مل من البروتين G فقط (بدون أجسام مضادة أحادية النسيلة). 3. حضّن الخلايا لمدة 2-12 ساعة عند 37 درجة مئوية. 4. اتبع بروتوكول تلوين البيوتين أنيكسين V لقياس موت الخلايا المبرمج. يمكن أيضًا ملاحظة موت الخلايا المبرمج (الاستماتة) باستخدام المجهر الضوئي، أو الرحلان الكهربائي الهلامي (سلالم تجزئة الحمض النووي)، أو باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي القائم على تجزئة الحمض النووي، مثل مجموعة APO-BRDU™ (رقم المنتج 556405) أو مجموعة APO-DIRECT™ (رقم المنتج 556381). بروتوكول تلوين البيوتين أنيكسين V: يُستخدم البيوتين أنيكسين V لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تخضع للاستماتة بشكل كمي ضمن مجموعة من الخلايا. يعتمد هذا البروتوكول على خاصية فقدان الخلايا لتناظر أغشيتها في المراحل المبكرة من الاستماتة. في الخلايا المستميتة، ينتقل الفوسفوليبيد الغشائي فوسفاتيديل سيرين (PS) من الطبقة الداخلية للغشاء البلازمي إلى الطبقة الخارجية، مما يعرضه للبيئة الخارجية. بروتين أنيكسين V هو بروتين يرتبط بالفوسفوليبيدات ويعتمد على الكالسيوم، وله ألفة عالية للفوسفاتيديل سيرين (PS)، ويُستخدم لتحديد الخلايا الميتة التي تظهر فيها جزيئات PS مكشوفة. أما بروبيديوم يوديد (PI) فهو كاشف قياسي لقياس حيوية الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي، ويُستخدم للتمييز بين الخلايا الحية وغير الحية. فالخلايا الحية ذات الأغشية السليمة لا تسمح بمرور PI، بينما تكون أغشية الخلايا الميتة والتالفة نفاذة له. الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لبروتين أنيكسين V المرتبط بالبيوتين وتلوينًا سلبيًا لـ PI تكون في طور الموت الخلوي المبرمج (الاستماتة). أما الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لكل من بروتين أنيكسين V المرتبط بالبيوتين و PI فتكون إما في المرحلة النهائية من الاستماتة، أو في طور النخر، أو ميتة بالفعل. بينما الخلايا التي تُظهر تلوينًا سلبيًا لكل من بروتين أنيكسين V المرتبط بالبيوتين و PI فتكون حية ولا تخضع لعملية استماتة قابلة للقياس. الكواشف: 1. بروتين أنيكسين V المرتبط بالبيوتين: مُضمن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. 2. بروبيديوم يوديد (PI): غير مُضمن. صبغة PI (رقم المنتج 556463) هي صبغة سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام لتلوين الأحماض النووية. استخدم ما يصل إلى 10 ميكرولتر لكل اختبار من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل. 3. محلول الربط 10×: غير مُضمّن. 0.1 مولار هيبس (الأس الهيدروجيني 7.4)، 1.4 مولار كلوريد الصوديوم، 25 ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء المنتج رقم 556454. 4. FITC-ستربتافيدين (رقم المنتج 554060): غير مُضمّن. التلوين: 1. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط 1× بتركيز 1 × 10⁶ خلية/مل. 2. انقل 100 ميكرولتر من المحلول (1 × 10⁵ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة 5 مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من بيوتين أنيكسين V. 4. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في الظلام. 5. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من محلول الربط المخفف (1×). 6. خفف 0.5 ميكروغرام من FITC-ستربتافيدين في 100 ميكرولتر من محلول الربط المخفف (1×)، ثم أضفه إلى راسب الخلايا. اخلط الخلايا برفق. 7. أضف 10 ميكرولتر من PI، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). قد يختلف التركيز الأمثل لـ PI بين سلالات الخلايا، حيث يُرجّح أن يكون 10 ميكرولتر من محلول تركيزه 50 ميكروغرام/مل هو الحد الأقصى المطلوب. قد تُعطي كميات أقل نتائج مثالية في بعض الأنظمة التجريبية. 8. أضف 400 ميكرولتر من محلول الربط المخفف (1×) إلى كل أنبوب. حلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: 1. خلايا مصبوغة فقط بـ FITC-Streptavidin. 2. خلايا مصبوغة بـ Biotin Annexin V + FITC-Streptavidin (بدون PI). 3. خلايا مصبوغة بـ PI + FITC-Streptavidin (بدون Biotin Annexin V). ضوابط تلوين أخرى: يُنصح باستخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام Biotin Annexin V و/أو Biotin Annexin V و PI. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المُحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (إيجابية لـ Biotin Annexin V، سلبية لـ PI أو إيجابية لـ Biotin Annexin V، إيجابية لـ PI). تُستخدم الخلايا غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا الميتة والخلايا التي تخضع للاستماتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي حُثّت على الخضوع للاستماتة بطرح نسبة الخلايا الميتة في الخلايا غير المعالجة من نسبة الخلايا الميتة في الخلايا المعالجة. ولأن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة ستكون ذات غشاء تالف وستُظهر تفاعلًا إيجابيًا مع كلٍ من بروبيديوم يوديد (PI) وبيوتين أنيكسين V. وبالتالي، لا يُميّز هذا الاختبار بين الخلايا التي خضعت بالفعل للاستماتة وتلك التي ماتت نتيجةً لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستُظهر الخلايا الميتة تفاعلًا إيجابيًا مع كلٍ من بيوتين أنيكسين V و PI.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.