BD، 557079، BD Pharmingen™، عنصر تحكم من نوع IgE κ نقي من الفئران

اسم بديل: مناهضة حزب العمال الوطني
النمط المصلي: IgE الفأري BALB/c، κ
المناعي: TNP-الهيموسيانين البطلينوس
التطبيق: اختبار ELISA، عنصر تحكم متماثل النمط (يتم اختباره بشكل روتيني)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_479637
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب. يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
إجراءات الفحص الموصى بها: يُعدّ C38-2 معيارًا مفيدًا في فحص ELISA الساندويتش للأجسام المضادة IgE في الفئران. ملاحظات حول بروتوكول فحص ELISA للأجسام المضادة IgE في الفئران: في معظم الحالات، يُعطي تغطية الصفيحة بالأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة بتركيز 2 ميكروغرام/مل، 100 ميكرولتر لكل بئر، والكشف باستخدام الأجسام المضادة الثانوية أحادية النسيلة المُؤشَّرة بالبيوتين بتركيز 2 ميكروغرام/مل، 100 ميكرولتر لكل بئر، إشارة مرضية للغاية. مع ذلك، وللحصول على إشارة مثالية، ينبغي على الباحثين معايرة كل جسم مضاد أحادي النسيلة ضمن نطاق من التركيزات (مثلًا، 1-8 ميكروغرام/مل). تُعدّ أوقات الحضانة المُوصى بها هي الظروف المُثلى للحصول على حساسية مثالية. أولًا: التغطية بالأجسام المضادة المُلتقطة: 1. خفّف الجسم المضاد المُلتقط للأجسام المضادة IgE في الفئران المُنقّى (رقم المنتج 553413، السلالة R35-72) إلى 2 ميكروغرام/مل في محلول التغطية. *انظر قسم المحاليل أدناه. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة ELISA المحسّنة لربط البروتين (مثل صفائح BD Falcon™ ELISA، BD Labware، رقم المنتج 353279). 2. انقر على الصفيحة للتأكد من تغطية جميع الآبار بمحلول الأجسام المضادة. 3. غطِّ الصفيحة واحضنها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. 4. اغسل الصفيحة 3 مرات بمحلول PBS/Tween*. في كل غسلة، املأ الآبار بـ 200 ميكرولتر من محلول PBS/Tween واتركها لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل شفط المحلول أو التخلص منه. كخطوة أخيرة، انقر على الصفيحة بمناشف ورقية لإزالة المحلول الزائد. ثانيًا: الحجب: 1. احجب الصفيحة بـ 200 ميكرولتر من محلول الحجب* لكل بئر. 2. غطِّ الصفيحة واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. 3. اغسل الصفيحة ثلاث مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. ثالثًا: تطبيق المعايير والعينات: 1. اترك العمود 1 كآبار فارغة (أي بدون إضافة مستضد، 100 ميكرولتر من محلول الحجب فقط لكل بئر). استخدم العمودين 2 و3 لتكرار المعيار، 100 ميكرولتر لكل بئر: خفف معيار IgE الفأري النقي (رقم المنتج 557079، المستنسخ C38-2؛ أو رقم المنتج 553481، المستنسخ 27-74) أو معيار IgE الفأري (رقم المنتج 557080، المستنسخ C48-2) في سلسلة من 8 تخفيفات ثنائية، في محلول الحجب، بدءًا من 0.5 ميكروغرام/مل. استخدم الأعمدة المتبقية لإضافة العينات بتخفيفات مختلفة في محلول الحجب، 100 ميكرولتر لكل بئر. ٢. غطِّ الصفيحة واحضنها لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند ٤ درجات مئوية. ٣. اغسل الصفيحة ٣ مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة ٤، من هذا البروتوكول. رابعًا: التحضين مع الجسم المضاد للكشف: ١. خفف الجسم المضاد IgE المضاد للفأر والموسوم بالبيوتين (رقم المنتج ٥٥٣٤١٩، المستنسخ R٣٥-١١٨) إلى ٢ ميكروغرام/مل في محلول الحجب. أضف ١٠٠ ميكرولتر لكل بئر. ٢. غطِّ الصفيحة واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. ٣. اغسل الصفيحة ٦ مرات بمحلول PBS/Tween، كما هو موضح في القسم الأول، الخطوة ٤، من هذا البروتوكول. خامساً: إضافة أفيدين- أو ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (Av-HRP أو SAv-HRP): 1. خفف Av-HRP (رقم المنتج 554058) أو SAv-HRP (رقم المنتج 554066) بنسبة 1:1000 في محلول الحجب. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر. 2. غطِ الصفيحة واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. 3. اغسل الصفيحة 6 مرات بمحلول PBS/Tween، كما في القسم الأول، الخطوة 4، من هذا البروتوكول. سادساً: إضافة الركيزة والتظهير: 1. قم بإذابة محلول الركيزة (ABTS)* خلال 20 دقيقة من الاستخدام. أضف 11 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين 30% (سيجما، رقم المنتج H1009) إلى 11 مل من محلول الركيزة وقم بالخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر فورًا، واتركه يتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. يمكن إيقاف التفاعل اللوني بإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من محلول SDS/DMF* (اختياري). 2. اقرأ اللوحة عند 405 نانومتر.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. يجب تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يُعد أزيد الصوديوم مثبطًا عكسيًا لعملية الأيض التأكسدي؛ لذلك، يجب عدم استخدام مستحضرات الأجسام المضادة التي تحتوي على هذه المادة الحافظة في مزارع الخلايا أو حقنها في الحيوانات. يمكن إزالة أزيد الصوديوم عن طريق غسل الخلايا المصبوغة أو الأجسام المضادة المرتبطة بالصفيحة أو عن طريق غسيل الأجسام المضادة الذائبة في محلول منظم خالٍ من أزيد الصوديوم. نظرًا لأن السموم الداخلية قد تؤثر أيضًا على نتائج الدراسات الوظيفية، فإننا نوصي باستخدام صيغة الأجسام المضادة NA/LE (خالية من الأزيد/منخفضة السموم الداخلية)، إن وجدت، للاستخدام في المختبر وفي الجسم الحي.