BD، 557599، BD™ DimerX DimerX I: بروتين اندماجي ثنائي قابل للذوبان معاد التركيب من الفأر CD1d:Ig

التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم التعبير عن بروتين CD1d:Ig المدمج للفأر مع β2M للفأر في سلالة خلايا ورم البلازما J558L (ATCC TIB-6). ترتبط سلاسل عديد الببتيد CD1d:Ig وβ2M بروابط غير تساهمية نتيجةً للتعبير المشترك عنهما داخل خلايا J558L. تم تنقية بروتين CD1d:Ig المدمج من سائل مزرعة الأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم التأكد من نقاء المستحضر بواسطة SDS-PAGE. تم اختبار CD1d:Ig بواسطة ELISA للتحقق من البروتين المدمج.
إجراءات الفحص الموصى بها: من الضروري تحميل أجزاء CD1d من البروتين الثنائي بمستضد ذي صلة قبل التلوين المناعي الفلوري لخلايا NKT. يتم تحميل معقدات CD1d:Ig بكفاءة عن طريق الحضانة مع فائض من المستضدات ذات الصلة (المحددة) أو غير ذات الصلة (الضابطة) (انظر البروتوكول 1). يمكن استخدام CD1d:Ig المحمل بالمستضد للتلوين المناعي الفلوري (انظر البروتوكول 2). نظرًا لاختلاف التطبيقات، يجب على كل باحث تحديد التخفيفات المناسبة للاستخدام الفردي. البروتوكول 1: تحميل المستضد لبروتين CD1d:Ig الثنائي. تم وصف العديد من بروتوكولات تحميل المستضد في الأدبيات العلمية. تتضمن الطريقة الموصى بها في BD Biosciences Pharmingen التحميل السلبي لفائض المستضد في المحلول مع بروتين CD1d:Ig. وقد وجدنا أن التحميل السلبي يعمل بشكل جيد بشكل خاص في حالة المستضدات ذات الألفة العالية. بالنسبة للمستضدات ذات الألفة المنخفضة، قد يؤدي رفع النسبة المولية للمستضد إلى بروتين الدايمر إلى تحسين التحميل، كما تم تحديده بواسطة تحليل التدفق الخلوي بناءً على نتائج منتجات BD Pharmingen DimerX الأخرى. يُقترح أن يقوم الباحث، لكل مستضد، بتحديد معايير مثل جرعة CD1d:Ig لكل مليون خلية، والنسبة المولية للمستضد إلى CD1d:Ig، ووقت تحميل المستضد تجريبيًا. تحضير المستضد وتحميله: 1. يجب تحديد الوزن الجزيئي (MW) للمستضد المطلوب. الوزن الجزيئي لـ α-GalCer هو 858 دالتون. 2. يُخلط بروتين CD1d:Ig مع المستضد النوعي أو مستضد التحكم بزيادة مولية (M) قدرها 10 أو 20 أو 40. يمكن استخدام الحساب التالي، باستخدام α-GalCer كمثال: Dg = الوزن الجزيئي للمستضد: على سبيل المثال، 858 دالتون. DCD1d = الوزن الجزيئي لـ CD1d:Ig = 250,000 دالتون. R = النسبة المولية الزائدة المطلوبة، على سبيل المثال، 40. Mg = ميكروغرام (ميكروغرام) من المستضد المطلوب. MCD1d = ميكروغرام (ميكروغرام) من CD1d:Ig في التفاعل. الكمية النموذجية من CD1d:Ig المحمل بالمستضد والمستخدمة في تلوين قياس التدفق الخلوي هي من 0.25 إلى 4 ميكروغرام/مليون خلية (للاختبار). Mg = MCD1d × R × Dg = 4 ميكروغرام × 40 × 858 دالتون = 0.55 ميكروغرام DCD1d / 250,000 دالتون. لذلك، يُضاف 0.55 ميكروغرام من المستضد و4 ميكروغرام من CD1d:Ig إلى المحلول للحصول على التحميل الأمثل للمستضد على CD1d:Ig. 3. امزج المستضد وCD1d:Ig معًا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بدرجة حموضة 7.2، ثم حضّن المزيج عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. يمكن تخزين CD1d:Ig المحمّل بالمستضد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. البروتوكول 2: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري 1. حضّر مزيج تلوين بروتين CD1d:Ig المحمّل بالببتيد عن طريق مزج 0.25 - 4 ميكروغرام من بروتين CD1d:Ig المحمّل بالببتيد لكل عينة مع 0.25 - 4 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج 550083) لكل عينة بنسبة 1:1 أو 1:2 من ثنائي الوحدات: الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1. حضّن المزيج لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واحفظه بعيدًا عن الضوء. ٢. أضف ٠٫٢٥ - ٤ ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A111-3 (رقم المنتج ٥٥٣٤٨٥) المُنقّى من نوع IgG1 للفأر إلى مزيج التلوين (انظر الخطوة ١ أعلاه). حضّن مزيج التلوين لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. ٣. أعد تعليق خلايا الفأر في محلول تلوين FACS [مثل DPBS، ١٪ FCS، ٠٫٠٩٪ NaN3 أو محلول تلوين BD Pharmingen™ (FBS)، رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦]، الذي يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد أحادي النسيلة 2.4G2 المُنقّى من نوع BD Fc Block™ المضاد لـ CD16/CD32 للفأر (رقم المنتج ٥٥٣١٤١/٥٥٣١٤٢)، بتركيز يقارب ١٠ × ١٠⁶ خلية لكل ٥٠ ميكرولتر. حضّن لمدة ١٠ دقائق عند ٤ درجات مئوية. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™ رقم المنتج 352008). 4. أضف 50 ميكرولتر من محلول FACS الذي يحتوي على الكمية المثلى من مزيج التلوين لكل اختبار إلى كل عينة، بالإضافة إلى أي أجسام مضادة أخرى خاصة بعلامات سطح الخلية المراد استخدامها. 5. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 × g، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي 0.5 مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي. البروتوكول 3: بديل: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري 1. أعد تعليق خلايا الفأر في محلول تلوين FACS [مثل DPBS، 1% FCS، 0.09% NaN3 أو محلول تلوين BD Pharmingen™ (FBS)، رقم المنتج 352008]. [رقم 554656]، يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد أحادي النسيلة 2.4G2 المضاد للفأر CD16/CD32 والمُنقّى بتقنية BD Fc Block™ (رقم المنتج 553141/553142)، بتركيز يقارب 10 × 10⁶ خلية لكل 50 ميكرولتر. حضّن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™ رقم المنتج 352008). 2. أضف من 0.25 إلى 4 ميكروغرام من بروتين CD1d:Ig المحمّل بالمستضد إلى معلق الخلايا. حضّن لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. 3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 × g، واسحب السائل الطافي. ٤. أعد تعليق الخلايا في ١٠٠ ميكرولتر من محلول FACS المحتوي على كاشف ثانوي فلوري مخفف بشكل مناسب. نستخدم عادةً الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج ٥٥٠٠٨٣). حضّن لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة عند ٤ درجات مئوية. ٥. اغسل الخلايا مرتين باستخدام ٢ مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × g، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي ٠.٥ مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي. *حقوق α-GalCer مملوكة لشركة Kirin Brewery. جزيء α-GalCer ومشتقاته مشمولة ببراءة الاختراع الأمريكية رقم ٥,٩٣٦,٠٧٦. لا يوجد ترخيص ضمني بموجب هذا لاستخدام α-GalCer.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.