BD، 557764، BD™ DimerX DimerX I: بروتين اندماجي بشري ثنائي قابل للذوبان معاد التركيب CD1d:Ig

النمط المصلي: IgG1 الفأري، λ
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)، قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره أثناء التطوير)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_2869093
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم التعبير عن البروتين المدمج CD1d:Ig البشري مع β2M البشري في سلالة خلايا ورم البلازما الفأري J558L (ATCC TIB-6). ترتبط سلاسل عديد الببتيد CD1d وβ2M بروابط غير تساهمية نتيجةً للتعبير المشترك عنهما داخل خلايا J558L. تم تنقية البروتين المدمج CD1d:Ig من سائل مزرعة الأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم التأكد من نقاء المستحضر بواسطة SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، أُضيف β2M البشري إلى الكاشف. تم اختبار البروتين المدمج CD1d:Ig البشري بواسطة ELISA للتحقق من البروتين المدمج.
إجراءات الفحص الموصى بها: من الضروري تحميل أجزاء CD1d من البروتين الثنائي بمستضد ذي صلة قبل التلوين المناعي الفلوري لخلايا NKT. يتم تحميل معقدات CD1d:Ig بكفاءة عن طريق الحضانة مع فائض من المستضدات ذات الصلة (المحددة) أو غير ذات الصلة (الضابطة) (انظر البروتوكول 1). يمكن استخدام CD1d:Ig المحمل بالمستضد للتلوين المناعي الفلوري (انظر البروتوكول 2). نظرًا لاختلاف التطبيقات، يجب على كل باحث تحديد التخفيفات المناسبة للاستخدام الفردي. البروتوكول 1: تحميل المستضد لبروتين CD1d:Ig الثنائي. تم وصف العديد من بروتوكولات تحميل المستضد. تتضمن الطريقة الموصى بها في BD Biosciences Pharmingen التحميل السلبي لفائض المستضد في المحلول مع بروتين CD1d:Ig. وجدنا أن التحميل السلبي يعمل بشكل جيد بشكل خاص في حالة المستضدات ذات الألفة العالية. بالنسبة للمستضدات ذات الألفة المنخفضة، قد يؤدي رفع النسبة المولية للمستضد إلى بروتين الدايمر إلى تحسين التحميل، كما تم تحديده بواسطة تحليل التدفق الخلوي بناءً على نتائج منتجات BD Pharmingen DimerX الأخرى. يُقترح أن يقوم الباحث، لكل مستضد، بتحديد معايير مثل جرعة CD1d:Ig لكل مليون خلية، والنسبة المولية للمستضد إلى CD1d:Ig، ووقت تحميل المستضد تجريبيًا. تحضير المستضد وتحميله: 1. يجب تحديد الوزن الجزيئي (MW) للمستضد المطلوب. الوزن الجزيئي لـ α-GalCer هو 858 دالتون. 2. يُخلط بروتين CD1d:Ig مع المستضد المحدد أو مستضد التحكم بزيادة مولية (M) قدرها 10 أو 20 أو 40. يمكن استخدام الحساب التالي، باستخدام α-GalCer كمثال: Dg = الوزن الجزيئي للمستضد: على سبيل المثال، 858 دالتون. DCD1d = الوزن الجزيئي لـ CD1d:Ig = 250,000 دالتون. R = النسبة المولية الزائدة المطلوبة، على سبيل المثال، 40. Mg = ميكروغرام (ميكروغرام) من المستضد المطلوب. MCD1d = ميكروغرام (ميكروغرام) من CD1d:Ig في التفاعل. الكمية النموذجية من CD1d:Ig المحمل بالمستضد والمستخدمة في تلوين قياس التدفق الخلوي هي من 0.25 إلى 4 ميكروغرام/مليون خلية (للاختبار). Mg = MCD1d × R × Dg = 4 ميكروغرام × 40 × 858 دالتون = 0.55 ميكروغرام DCD1d / 250,000 دالتون. لذلك، يُضاف 0.55 ميكروغرام من المستضد و4 ميكروغرام من CD1d:Ig إلى المحلول للحصول على التحميل الأمثل للمستضد على CD1d:Ig. 3. امزج المستضد وCD1d:Ig معًا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بدرجة حموضة 7.2، ثم حضّن المزيج عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. يمكن تخزين CD1d:Ig المحمّل بالمستضد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. *ملاحظة: حقوق α-GalCer مملوكة لشركة Kirin Brewery. جزيء α-GalCer ومشتقاته محمية بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 5,936,076. لا يوجد ترخيص ضمني لاستخدام α-GalCer بموجب هذه الاتفاقية. البروتوكول 2: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري 1. أعد تعليق الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) أو الخلايا المستهدفة في محلول تلوين FACS [مثل محلول التلوين BD Pharmingen™ مع BSA، رقم المنتج 554657]، بتركيز يقارب 10 × 10⁶ خلية لكل 50 ميكرولتر. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثلاً، أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™ رقم المنتج 352008). 2. حضّر مزيج تلوين بروتين CD1d:Ig المحمّل بالمستضد بمزج 0.25 - 4 ميكروغرام من بروتين CD1d:Ig المحمّل بالمستضد لكل عينة مع 0.25 - 4 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج 550083) لكل عينة بنسبة 1:1 أو 1:2 من ثنائي الوحدات: الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1. حضّن المزيج لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واحفظه بعيدًا عن الضوء. 3. أضف 1-2 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة A111-3 (رقم المنتج 553485) من نوع IgG1 النقي للفأر لكل عينة إلى مزيج التلوين (انظر الخطوة 2 أعلاه). حضّن مزيج التلوين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع حمايته من الضوء. 4. حضّر IgG البشري متعدد النسائل النقي بتركيز 0.2 ملغ/مل تقريبًا في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) بدرجة حموضة 7.2. 5. أضف 10 ميكرولتر (2 ميكروغرام) من محلول IgG البشري المركز لكل أنبوب لمنع الارتباط غير النوعي لـ DimerX I أو كواشف الأجسام المضادة بمستقبلات Fc السطحية. حضّن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. 6. أضف 50 ميكرولتر من محلول FACS الذي يحتوي على الكمية المثلى من مزيج التلوين لكل عينة، بالإضافة إلى أي أجسام مضادة أخرى خاصة بعلامات سطح الخلية سيتم استخدامها لكل عينة. 7. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 250 × g، وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا في محلول FACS وحللها باستخدام قياس التدفق الخلوي. البروتوكول 3: بديل: بروتوكول التلوين المناعي الفلوري 1. أعد تعليق الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي أو الخلايا المستهدفة في محلول تلوين FACS [مثل DPBS، 1% FCS، 0.09% NaN3 أو محلول تلوين BD Pharmingen™ (FBS)، رقم المنتج 554656] بتركيز يقارب 10 × 10⁶ خلية لكل 50 ميكرولتر. أضف حوالي 1 × 10⁶ خلية لكل أنبوب تلوين (مثل أنبوب 12 × 75 مم، BD Falcon™، رقم المنتج 352008). ٢. حضّر الغلوبولين المناعي البشري IgG متعدد النسائل النقي بتركيز ٠٫٢ ملغم/مل تقريبًا في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) بدرجة حموضة ٧٫٢. ٣. أضف ١٠ ميكرولتر (٢ ميكروغرام) من محلول الغلوبولين المناعي البشري IgG المركز لكل أنبوب لمنع الارتباط غير النوعي لـ DimerX I أو كواشف الأجسام المضادة بمستقبلات Fc السطحية. حضّن لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ٤. أضف من ٠٫٢٥ إلى ٤ ميكروغرام من بروتين CD1d:Ig المحمّل بالمستضد إلى معلق الخلايا. حضّن لمدة ٦٠ دقيقة عند ٤ درجات مئوية. ٥. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام ٢ مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × g، وتخلص من السائل الطافي. ٦. أضف مرة أخرى ١٠ ميكرولتر (٢ ميكروغرام) من الغلوبولين المناعي البشري IgG متعدد النسائل النقي لكل عينة. ٧. أعد تعليق الخلايا في ١٠٠ ميكرولتر من محلول FACS المحتوي على كاشف فلوري ثانوي مخفف بشكل مناسب. نستخدم عادةً الجسم المضاد أحادي النسيلة A85-1 المرتبط بـ PE (مضاد IgG1 للفأر، رقم المنتج ٥٥٠٠٨٣). حضّن لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة عند ٤ درجات مئوية. ٨. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام ٢ مل من محلول FACS، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ٢٥٠ × g، وتخلص من السائل الطافي. ٩. كرر الخطوتين ٧ و٨ لوسم علامات سطح الخلية باستخدام الجسم المضاد المناسب المرتبط بالفلوركروم (تجنب استخدام الأجسام المضادة ذات النمط المتماثل IgG1 للفأر لتقليل التشويش). ١٠. أعد تعليق الخلايا المترسبة في حوالي ٠.٥ مل من محلول التلوين في أنبوب مناسب لجهاز قياس التدفق الخلوي، ثم قم بالتحليل.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي.