BD، 557812، BD IMag™ جزيئات ستربتأفيدين بلس - DM

التطبيق: فصل الخلايا (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_10050580
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل ظروف مثالية، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول مفصل للوسم والفصل المغناطيسي. باختصار، تُوسم الخلايا بالأجسام المضادة المُؤَشَّرة بالبيوتين، والتي تتعرف على المجموعة الفرعية المستهدفة. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus -DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالأجسام المضادة المُؤَشَّرة بالبيوتين على سطح الخلايا. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية الاختيار الإيجابي أو الاستنزاف. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة معلقةً ليسهل سحبها (الجزء المستنفد أو السالب). ثم يُزال الأنبوب من المجال المغناطيسي لإعادة تعليق الجزء الموجب. تُكرر عمليات الاختيار مرتين لزيادة نقاء الجزء الموجب وكمية الجزء المستنفد. تُوضح خطوات الفصل المغناطيسي في مخططات التدفق المرفقة الخاصة بالاستنزاف والاختيار الإيجابي. يُتيح صغر حجم جزيئات BD IMag™ إمكانية تقييم الجزء الإيجابي بشكلٍ أدق في تطبيقات لاحقة، مثل قياس التدفق الخلوي. وتُستخدم تراكيز مثلى من جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus -DM للاختيار الإيجابي باستخدام بعض الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المُؤشَّرة بالبيوتين لمستضدات الكريات البيضاء البشرية والفأرية. رقم الكتالوج، نوع الجسم المضاد، خصوصية الجسم المضاد، BD IMag، ستربتأفيدين، تركيز الجسيمات، النسيج المستخدم: 555411، HIB19، بشري، CD19، 20 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، PBMC؛ 555338، HIT3a، بشري، CD3، 20 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، PBMC؛ 551331، RA3-6B2، فأر، CD45R، 20 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، طحال؛ 551335، 30-H12، فأر، CD90.2، 20 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، طحال؛ 551326، 53-6.7، فأر، CD8a، 20 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، طحال؛ 551324، RM4-5، فأر، CD4، 10 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، طحال؛ 551328، M1/70، فأر CD11b 20 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، نخاع عظمي 551333، RB6-8C5 فأر Ly-6G/Ly-6C 50 ميكرولتر/10^7 خلية إجمالية، نخاع عظمي. لاستنزاف خلايا الدم المكونة للدم في الفئران التي تحمل علامات خاصة بالسلالة، نوصي باستخدام مجموعة BD™ IMag Mouse Hematopoietic Stem Cell Enrichment Set - DM (رقم المنتج 558451). بروتوكول الوسم والفصل المغناطيسي: 1. تحضير المحاليل المنظمة ووضعها على الثلج. أ. محلول تلوين الخلايا: محلول ملحي منظم بالفوسفات، 3% مصل جنيني بقري معطل حرارياً، 0.1% أزيد الصوديوم. ب. محلول BD IMag المخفف (1X): خفف محلول BD™ IMag المخفف (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم، أو حضّر محلول ملحي فوسفاتي مُدعّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA)، و2 ملي مول من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA)، و0.1% من أزيد الصوديوم.* 2. حضّر معلقًا خلويًا أحاديًا من النسيج اللمفاوي المطلوب بطريقة معقمة، أو حضّر خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) من دم مضاد للتخثر، ويفضل استخدام الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-هايباك ذي الكثافة المناسبة. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام 70 ميكرومتر. 3. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول تلوين الخلايا بتركيز 2 × 10^7 خلية/مل. ٤. اختياري: إذا لزم الأمر، أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 (رقم المنتج 553141/553142) أو الجسم المضاد أحادي النسيلة BD Rat Fc Block™ Purified Anti-Rat CD32 mAb D34-485 (رقم المنتج 550270/550271) بتركيز 0.25 ميكروغرام/10^6 خلية، ثم حضّن المزيج على الجليد لمدة 15 دقيقة. ٥. أضف الجسم المضاد المُؤشَّر بالبيوتين (أو مزيج الأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين) بالتركيز المناسب، ثم حضّن المزيج على الجليد لمدة 15 دقيقة.† ٦. اغسل الخلايا المُوسومة بكمية كبيرة من محلول BD IMag™ المخفف (1X)، ثم اسحب السائل الطافي بالكامل بعناية. لإجراء عمليات الاستنزاف، انتقل إلى الخطوة 7. لإجراء عمليات الاختيار الإيجابي، انتقل إلى الخطوة 18. عمليات الاستنزاف: 7. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف 50 ميكرولتر من الجسيمات لكل 1 × 10^7 خلية. 8. اخلط جيدًا. ضع كريات الدم البيضاء للفئران أو الجرذان في الثلاجة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة تتراوح بين 6 و12 درجة مئوية. حضّن خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMC) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.† 9. ارفع حجم الوسم إلى 2 إلى 8 × 10^7 خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف 1X أو وسط الاستنبات.* 10. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير 12 × 75 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 1.0 مل. ضع أنبوب الجزء الإيجابي هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة 6 إلى 8 دقائق. لزيادة الحجم، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير مقاس 17 × 100 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 3.0 مل. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق. 11. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية، اسحب السائل الطافي (الجزء المستنفد) بعناية وضعه في أنبوب جديد. 12. أزل أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ المخفف (أو الوسط) بنفس الحجم كما في الخطوة 9. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والضخ بالماصة من 10 إلى 15 مرة، ثم أعده إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق. - أنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. ١٣. باستخدام ماصة باستور جديدة، اسحب السائل الطافي (جزء الغسيل) بحرص واجمعه مع الجزء المستنفد من الخطوة ١١ أعلاه. ١٤. كرر الخطوتين ١٢ و١٣. يحتوي الجزء المستنفد المدمج على خلايا خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية المرتبطة بها. هذه الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة، أو يمكن إثراؤها أكثر بالانتقال إلى الخطوة ١٦. ١٥. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم مناسب أو وسط زراعة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي. ١٦. لزيادة نقاء الجزء المستنفد المدمج، ضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق إضافية. - أنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٧. اسحب السائل الطافي بحرص وضعه في أنبوب جديد. هذا هو الجزء المستنفد النهائي. الخلايا جاهزة للمعالجة للتطبيقات اللاحقة. الاختيارات الإيجابية: ١٨. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف من ١٠ إلى ٥٠ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠^٧ خلية. تختلف كمية الجسيمات المضافة حسب عدد الخلايا المستهدفة وكثافة المستضد على سطح الخلية. يُرجى الرجوع إلى معلومات التركيز الأمثل في الصفحة ٢ للاطلاع على بعض الأمثلة الشائعة. ١٩. امزج جيدًا. ضع كريات الدم البيضاء للفئران أو الجرذان في الثلاجة لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٦-١٢ درجة مئوية. حضّن خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMC) في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة.† ٢٠. ارفع حجم الوسم إلى ٢ إلى ٨ × ١٠^٧ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف ١X. ٢١. ضع الأنبوب فورًا على مغناطيس فصل الخلايا وحضّنه لمدة ٦ إلى ٨ دقائق. ٢٢. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، اسحب السائل الطافي بحرص. يُعتبر هذا السائل الطافي الجزء السالب. ٢٣. أزل الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز ١X إلى نفس الحجم كما في الخطوة ٢٠. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة تتراوح بين ٢ و٤ دقائق أخرى. ٢٤. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، اسحب السائل الطافي (جزء الغسل) بحرص. ٢٥. كرر الخطوتين ٢٣ و٢٤. ٢٦. بعد خطوة الغسل الأخيرة، أزل الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا. أعد تعليق الجزء الموجب في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب، وتابع التطبيقات اللاحقة المطلوبة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي. ملاحظات: *لاستنزاف كريات الدم البيضاء للفئران، عادةً ما يؤدي استخدام وسط زراعة الأنسجة إلى زيادة طفيفة في حيوية الخلايا واستعادة الخلايا، مقارنةً بمحلول IMag، دون التأثير على نقاء الخلايا. نوصي الباحثين بإجراء مقارنة تجريبية بين الأوساط والمحلول المنظم للتأكد من عدم وجود أي آثار جانبية. †تجنبوا وضع علامات غير محددة من خلال العمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يجب استخدام عنصر تحكم متماثل النمط بنفس تركيز الجسم المضاد المطلوب. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، وهي من إنتاج شركة Skold Technology ومرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. يُرجى زيارة http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS). يرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.