BD، 557899، جزيئات مغناطيسية مضادة لـ R-Phycoerythrin (PE) من BD IMag™ - DM

النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
المستضد: آر-فيكوإريثرين
التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
RRID: AB_398634
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: بروتوكول الوسم والفصل المغناطيسي 1. حضّر المحاليل التالية وضعها على الثلج: أ. محلول تلوين الخلايا: محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات، 3% مصل جنيني بقري مُعطَّل حراريًا، 0.1% أزيد الصوديوم. ب. محلول BD IMag™ 1X: خفّف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم، أو بدلاً من ذلك، حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات، مُدعَّم بـ 0.5% ألبومين مصل البقر، 2 ملي مول من EDTA، و0.1% أزيد الصوديوم.* 2. حضّر معلقًا من خلية واحدة من النسيج اللمفاوي المطلوب، أو حضّر خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) من دم مُضاد للتخثر، ويُفضَّل استخدام الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول Ficoll-Hypaque™ ذي الكثافة المناسبة. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام 70 ميكرومتر. 3. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول تلوين الخلايا بتركيز 2 × 10⁷ خلية/مل. 4. اختياري: إذا لزم الأمر، أضف BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (رقم المنتج 553141) أو BD Rat Fc Block™ Purified Anti-Rat CD32 (رقم المنتج 550270) بتركيز 0.25 ميكروغرام/10⁶ خلية، وحضّن على الجليد لمدة 15 دقيقة. 5. أضف الجسم المضاد المقترن بـ PE (أو مزيج الأجسام المضادة) بالتركيز المناسب، وحضّن على الجليد لمدة 15 دقيقة. † 6. اغسل الخلايا المُلَوَّنة بكمية زائدة من محلول BD IMag™ بتركيز 1X، واسحب كل السائل الطافي بعناية. لإجراء عملية الاستنزاف، انتقل إلى الخطوة 7. لإجراء عملية الاختيار الإيجابي، انتقل إلى الخطوة 18. الاستنزاف: 7. رجّ جزيئات Anti-R-Phycoerythrin (PE) المغناطيسية - DM جيدًا، وأضف 50 ميكرولتر من الجزيئات لكل 1 × 10⁷ خلية إجمالية. 8. امزج جيدًا. حضّن كريات الدم البيضاء للفئران/الجرذان لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 6-12 درجة مئوية، وخلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMC) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. † 9. ارفع حجم الوسم إلى تركيز 2-8 × 10⁷ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ 1X أو وسط الاستنبات.* 10. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير 12 × 75 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 1.0 مل. ضع أنبوب الجزء الإيجابي هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة 6-8 دقائق. - لزيادة الحجم، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير مقاس 17 × 100 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 3.0 مل. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق. 11. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، استخدم ماصة باستور زجاجية لسحب السائل الطافي (الجزء المستنفد) إلى أنبوب جديد. 12. أزل أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ المخفف (أو الوسط) بنفس الحجم كما في الخطوة 9. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة 10-15 مرة، ثم أعده إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6-8 دقائق. - أنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. 13. باستخدام ماصة باستور جديدة، اسحب السائل الطافي بحرص واخلطه مع الجزء المستنفد من الخطوة 11 أعلاه. ١٤. كرر الخطوتين ١٢ و١٣. يحتوي الجزء المستنفد المجمع على خلايا خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية المرتبطة بها. هذه الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة، أو يمكن زيادة تركيزها بالانتقال إلى الخطوة ١٦. ١٥. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي. ١٦. لزيادة نقاء الجزء المستنفد المجمع، ضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦-٨ دقائق إضافية. - أنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٧. اسحب السائل الطافي (الجزء المستنفد النهائي) بعناية في أنبوب جديد. الخلايا جاهزة للمعالجة للتطبيقات اللاحقة. الاختيارات الإيجابية: ١٨. رجّ جزيئات المغناطيس المضادة لـ R-Phycoerythrin (PE) - DM جيدًا، وأضف ١٠-٥٠ ميكرولتر من الجزيئات لكل ١ × ١٠⁷ خلية. ملاحظة: قد تختلف كمية الجزيئات المضافة حسب عدد الخلايا المستهدفة وكثافة المستضد على سطح الخلية. يرجى الرجوع إلى الجدول ١ للاطلاع على بعض الأمثلة الشائعة. ١٩. امزج جيدًا. حضّن كريات الدم البيضاء للفئران/الجرذان لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٦-١٢ درجة مئوية، وخلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMC) في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة. ٢٠. ارفع حجم الوسم إلى تركيز ٢-٨ × ١٠⁷ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ بتركيز ١X. ٢١. ضع الأنبوب فورًا على مغناطيس فصل الخلايا وحضّنه لمدة ٦-٨ دقائق. ٢٢. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، اسحب السائل الطافي بحرص. هذا السائل الطافي هو الجزء السالب. ٢٣. أخرج الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز ١X إلى نفس الحجم كما في الخطوة ٢٠. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٢-٤ دقائق أخرى. ٢٤. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، اسحب السائل الطافي بحرص. ٢٥. كرر الخطوتين ٢٣ و٢٤. ٢٦. بعد خطوة الغسل الأخيرة، أخرج الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا. أعد تعليق الجزء الموجب في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب، وتابع التطبيقات اللاحقة المطلوبة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي. ملاحظات: * عند استنفاد كريات الدم البيضاء للفئران، عادةً ما يؤدي استخدام وسط زراعة الأنسجة إلى زيادة طفيفة في حيوية الخلايا واستعادة الخلايا، مقارنةً بمحلول IMag، دون التأثير على نقاء الخلايا. نظرًا لاختلاف التطبيقات، يُنصح الباحثون بإجراء مقارنة تجريبية بين أوساط الاستنبات ومحلول IMag للتأكد من عدم وجود آثار جانبية. † تجنب وضع علامات غير محددة بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، وهي من إنتاج شركة Skold Technology ومرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. Ficoll-Paque هي علامة تجارية لشركة Amersham Biosciences Limited. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.