BD، 557932، جسيمات مغناطيسية BD IMag™ APC - DM

النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
RRID: AB_398637
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول مفصل للوسم والفصل المغناطيسي. باختصار، تُوسم الخلايا بالأجسام المضادة المقترنة بـ APC، والتي تتعرف على المجموعة الفرعية المستهدفة. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ المضادة لـ APC - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالأجسام المضادة المقترنة بـ APC على سطح الخلايا. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي. بعد ذلك، تُجرى عملية الاختيار الإيجابي أو الاستنزاف. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة معلقةً ليسهل سحبها (الجزء المستنفد أو السالب). ثم يُزال الأنبوب من المجال المغناطيسي لإعادة تعليق الجزء الموجب. تُكرر عمليات الاختيار مرتين لزيادة نقاء الجزء الموجب وكمية الجزء المستنفد. تُوضح خطوات الفصل المغناطيسي في مخططات التدفق المرفقة الخاصة بالاستنزاف والاختيار الإيجابي. يُتيح صغر حجم جزيئات BD IMag™ إمكانية تقييم الجزء الموجب بشكلٍ أدق في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي. بروتوكول الوسم والفصل المغناطيسي: 1. تحضير المحاليل المنظمة ووضعها على الثلج. أ. محلول تلوين الخلايا: محلول ملحي مُخفف بالفوسفات، 3% مصل جنيني بقري مُعطل حراريًا، 0.1% أزيد الصوديوم. ب. محلول BD IMag™ المخفف (1X): خفف محلول BD IMag™ المخفف (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم، أو حضّر محلول ملحي فوسفاتي مُدعّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA)، و2 ملي مول من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA)، و0.1% من أزيد الصوديوم.* 2. حضّر معلقًا خلويًا أحاديًا من النسيج اللمفاوي المطلوب بطريقة معقمة، أو حضّر خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) من دم مُعالج بمضادات التخثر، ويُفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك ذي الكثافة المناسبة. أزل تجمعات الخلايا و/أو الحطام بتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام 70 ميكرومتر. 3. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول تلوين الخلايا بتركيز 2 × 10⁷ خلية/مل. ٤. اختياري: إذا لزم الأمر، أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 (رقم المنتج 553141/553142) أو الجسم المضاد أحادي النسيلة BD Rat Fc Block™ Purified Anti-Rat CD32 mAb D34-485 (رقم المنتج 550270/550271) بتركيز 0.25 ميكروغرام/10⁶ خلية، ثم حضّن المزيج على الجليد لمدة 15 دقيقة. ٥. أضف الجسم المضاد المرتبط بـ APC (أو مزيجًا من الأجسام المضادة المرتبطة بـ APC) بالتركيز المناسب، ثم حضّن المزيج على الجليد لمدة 15 دقيقة. ٦. اغسل الخلايا الموسومة بكمية كبيرة من محلول BD IMag™ المخفف (1X)، ثم اسحب السائل الطافي بالكامل بعناية. لإجراء عملية الاستنزاف، انتقل إلى الخطوة 7. لإجراء عملية الاختيار الإيجابي، انتقل إلى الخطوة 18. الاستنزاف: 7. رجّ جزيئات BD IMag™ المضادة لـ APC - DM جيدًا، وأضف 50 ميكرولتر من الجزيئات لكل 1 × 10⁷ خلية إجمالية. 8. اخلط جيدًا. ضعه في الثلاجة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة تتراوح بين 6 و12 درجة مئوية. 9. ارفع حجم الوسم إلى تركيز يتراوح بين 2 و8 × 10⁷ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف أو وسط الاستنبات.* 10. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير بأبعاد 12 × 75 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 1.0 مل. ضع أنبوب الجزء الإيجابي هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة تتراوح بين 6 و8 دقائق. - لزيادة الحجم، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير مقاس 17 × 100 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 3.0 مل. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق. 11. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية، اسحب السائل الطافي (الجزء المستنفد) بعناية وضعه في أنبوب جديد. 12. أزل أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ المخفف (أو الوسط) بنفس الحجم كما في الخطوة 9. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والضخ بالماصة من 10 إلى 15 مرة، ثم أعده إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة 6 إلى 8 دقائق. - أنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. ١٣. باستخدام ماصة باستور جديدة، اسحب السائل الطافي بحرص واخلطه مع الجزء المستنفد من الخطوة ١١ أعلاه. ١٤. كرر الخطوتين ١٢ و١٣. يحتوي الجزء المستنفد المدمج على خلايا خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية المرتبطة بها. هذه الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة، أو يمكن إثراؤها بشكل أكبر باتباع الخطوة ١٦. ١٥. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم مناسب أو وسط زراعة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي. ١٦. لزيادة نقاء الجزء المستنفد المدمج، ضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٦ إلى ٨ دقائق إضافية. - أنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق. ١٧. اسحب السائل الطافي بحرص وضعه في أنبوب جديد. هذا هو الجزء المستنفد النهائي. الخلايا جاهزة للمعالجة للتطبيقات اللاحقة. الاختيارات الإيجابية: ١٨. رجّ محلول BD IMag™ Anti-APC Particles - DM جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم أضف من ١٠ إلى ٥٠ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠⁷ خلية. تختلف كمية الجسيمات المضافة حسب عدد الخلايا المستهدفة وكثافة المستضد على سطح الخلية. يُرجى مراجعة الجدول أدناه للاطلاع على بعض الأمثلة الشائعة. ١٩. اخلط جيدًا. ضع كريات الدم البيضاء للفئران أو الجرذان في الثلاجة لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة تتراوح بين ٦ و١٢ درجة مئوية. حضّن خلايا الدم المحيطية البشرية (PBMC) في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة. ٢٠. ارفع حجم الوسم إلى ٢ إلى ٨ × ١٠⁷ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف ١X. ٢١. ضع الأنبوب فورًا على مغناطيس فصل الخلايا وحضّنه لمدة تتراوح بين ٦ و٨ دقائق. ٢٢. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، اسحب السائل الطافي بحرص. يُعتبر هذا السائل الطافي الجزء السالب. ٢٣. أزل الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز ١X إلى نفس الحجم كما في الخطوة ٢٠. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة تتراوح بين ٢ و٤ دقائق أخرى. ٢٤. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، اسحب السائل الطافي بحرص. ٢٥. كرر الخطوتين ٢٣ و٢٤. ٢٦. بعد خطوة الغسل الأخيرة، أزل الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا. أعد تعليق الجزء الموجب في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب، وتابع التطبيقات اللاحقة المطلوبة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي. ملاحظات: * عند استنفاد كريات الدم البيضاء للفئران، عادةً ما يؤدي استخدام وسط زراعة الأنسجة إلى زيادة طفيفة في حيوية الخلايا واستعادة الخلايا، مقارنةً بمحلول IMag، دون التأثير على نقاء الخلايا. نوصي الباحثين بإجراء مقارنة تجريبية بين الأوساط والمحلول المنظم للتأكد من عدم وجود أي آثار جانبية. ** تجنبوا وضع علامات غير محددة من خلال العمل بسرعة والالتزام بفترات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، وهي من إنتاج شركة Skold Technology ومرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. Ficoll-Paque هي علامة تجارية لشركة Amersham Biosciences Limited. يمكن استخدام هذا الكاشف المُقترن بـ APC في أي جهاز قياس تدفق خلوي مزود بليزر صبغي أو ليزر هيليوم-نيون أو ليزر ثنائي أحمر. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.