مجموعة إثراء الخلايا الجذعية المكونة للدم (الخلايا السلفية) للفئران BD IMag™، رقم 558451 - DM

التفاعل: الفأر (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869178
الوصف: تتفاعل مجموعة BD IMag™ Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Enrichment Set - DM مع خلايا من السلالات الرئيسية للخلايا المكونة للدم، مثل الخلايا اللمفاوية التائية، والخلايا اللمفاوية البائية، والخلايا الوحيدة/البلعمية، والخلايا المحببة، وخلايا الدم الحمراء. تتكون جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM من جسيمات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. صُممت هذه المجموعة للإثراء المناعي المغناطيسي للخلايا السلفية المكونة للدم من نخاع عظم الفأر عن طريق استنزاف الخلايا الملتزمة بالسلالات اللمفاوية التائية والبائية، والنخاعية (الوحيدة والمحببة)، والحمراء. تحتوي المجموعة على كمية كافية من الكواشف لوسم 10^9 خلية من خلايا نخاع العظم. يتكون كوكتيل استنزاف سلالة الفئران البيوتين من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية المرتبطة بالبيوتين: مضاد CD3e للفئران، المستنسخ 145-2C11؛ مضاد CD11 للفئران، المستنسخ M1/70؛ مضاد CD45R/B220 للفئران، المستنسخ RA3-6B2؛ مضاد Ly-6G وLy-6C (Gr-1) للفئران، المستنسخ RB6-8C5؛ مضاد TER-119/الخلايا الحمراء للفئران، المستنسخ TER-119.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والاستنزاف المفصل. باختصار، يقوم مزيج استنزاف سلالة خلايا الفأر المُوسَم بالبيوتين بتلوين خلايا الدم الملتزمة بسلالة معينة في آنٍ واحد، وذلك وفقًا لخصائصها المختلفة. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُوسَمة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، يُجرى اختيار سلبي لإثراء الخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتزمة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المستنفد). تُجرى عمليات اختيار سلبي إضافية لتحسين كمية ونقاء الجزء المستنفد. تُوضح خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسياب الاستنزاف. يمكن تقييم كل من الأجزاء الموجبة والمستنفدة في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة في كوكتيل استنفاد سلالة الفئران المُبَيوْتَنة وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لإثراء الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظم. بروتوكول الوسم المغناطيسي والاستنفاد: 1. تحضير محاليل معقمة ووضعها على الثلج. أ. محلول تلوين الخلايا: محلول ملحي مُخَفَّف بالفوسفات مُدَعَّم بـ 3% من مصل العجل الجنيني المُعَطَّل حراريًا و0.1% من أزيد الصوديوم. ب. محلول BD IMag™ 1X: تخفيف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم أو تحضير محلول ملحي مُخَفَّف بالفوسفات مُدَعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري، و2 ملي مول من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك، و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر معلقًا خلويًا أحاديًا من نخاع عظم الفأر بطريقة معقمة. أزل تكتلات الخلايا و/أو الشوائب بتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلايا من النايلون بمسام ٧٠ ميكرومتر. ملاحظة: عادةً ما ينتج عظم الفخذ وعظم الساق لفأر بالغ واحد ما بين ٢٠ و٦٠ × ١٠^٦ خلية مكونة للدم. ينتج عن فأر واحد ما يقارب ٠.٣ إلى ١.٠ × ١٠^٦ خلية سالبة السلالة. ٣. عدّ الخلايا وأعد تعليقها في محلول تلوين الخلايا المعقم بتركيز يتراوح بين ١٠ و٢٠ × ١٠^٦ خلية/مل. احتفظ بعينة من الخلايا غير المصبوغة (حوالي 5 × 10^6 خلية) لاستخدامها في تحليل التدفق الخلوي في الخطوة 17. 4. أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة 2.4G2 المضاد للفأر CD16/CD32 والمُنقّى بواسطة BD Fc Block™ (رقم المنتج 553141/553142) بتركيز 0.25 ميكروغرام/10^6 خلية، وحضّنها على الجليد لمدة 15 دقيقة. 5. أضف مزيج استنزاف سلالة الفأر المُؤشّر بالبيوتين بتركيز 5 ميكرولتر لكل 1 × 10^6 خلية، وحضّنها على الجليد لمدة 15 دقيقة. 6. اغسل الخلايا المُوسومة بحجم زائد 10 أضعاف من محلول BD IMag™ المُخفّف (1X)، ثمّ قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 7 دقائق، واسحب السائل الطافي بالكامل بعناية. ٧. رجّ محلول BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأضف ٥ ميكرولتر من الجسيمات لكل ١ × ١٠^٦ خلية. ٨. اخلط جيدًا. ضعه في الثلاجة لمدة ٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٦-١٢ درجة مئوية. ٩. ارفع حجم الوسم إلى ٢٠-٨٠ × ١٠^٦ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف ١X. ١٠. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٢ × ٧٥ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ١.٠ مل. ضع أنبوب الفصل الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الأفقي) لمدة ٨ دقائق. - للحصول على حجم أكبر، انقل الخلايا إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير ١٧ × ١٠٠ مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف ٣.٠ مل. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس فصل الخلايا (في الوضع الرأسي) لمدة 10 دقائق. 11. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المستنفد) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. 12. أزل أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز 1X إلى نفس الحجم كما في الخطوة 9. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من 10 إلى 15 مرة، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا لمدة 8 دقائق. - أنبوب 17 × 100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة 10 دقائق. 13. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بعناية واخلطه مع الجزء المستنفد من الخطوة 11 أعلاه. ١٤. يمكن إعادة تعليق خلايا الجزء الموجب المتبقية في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط استنبات مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. ١٥. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المستنفد المجمع على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ٨ دقائق أخيرة. - أنبوب ١٧ × ١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ١٠ دقائق. ١٦. اسحب السائل الطافي بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو الجزء المستنفد النهائي الذي يحتوي على الخلايا الجذعية المكونة للدم الغنية. الخلايا جاهزة للمعالجة للتطبيقات اللاحقة. ١٧. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي والأجزاء الموجبة والنهائية المستنفدة بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة إجراء فصل الخلايا. ملاحظات: - بعد غسل الأجسام المضادة البيوتينيلية الزائدة، اسحب السائل الطافي تمامًا. سيؤدي بقاء السائل الطافي في الأنبوب إلى زيادة حجم الوسم، مما سيقلل من كفاءة الوسم المغناطيسي. عند وسم الخلايا باستخدام جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM، استخدم محلولًا خاليًا من البيوتين فقط. سيتنافس البيوتين الحر مع الجسم المضاد المُبيوتيني على الارتباط بجزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM. تجنب الوسم غير النوعي بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة بمجموعات الكربوكسيل، تُصنّعها شركة Skold Technology بموجب ترخيص براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. تحذير: يُنتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. لذا، يُرجى تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. يُرجى مراجعة الموقع الإلكتروني www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح