BD، 558521، مجموعة إثراء الخلايا التائية CD4 الساذجة البشرية BD IMag™ - DM

التطبيق: فصل الخلايا (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869213
الوصف: تُستخدم مجموعة BD IMag™ Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Set - DM للاختيار السلبي للخلايا التائية المساعدة الساذجة غير المعالجة من الدم المحيطي. يحتوي مزيج BD IMag™ Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Set على أجسام مضادة أحادية النسيلة مُؤشَّرة بالبيوتين، تتعرف على المستضدات الموجودة على الخلايا التائية الذاكرة، والخلايا التائية السامة للخلايا (CD8+)، والخلايا البائية، والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا التائية γ/δ، والخلايا الوحيدة، والخلايا المتغصنة، والخلايا المحببة، والصفائح الدموية، والخلايا الحمراء. أما جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM فهي جزيئات نانوية مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بالستربتافيدين على أسطحها. بفضل هذين المكونين، تتجنب هذه المجموعة التنشيط غير المقصود للخلايا التائية المساعدة الساذجة المُخصَّبة، وذلك باستخدام كواشف لا ترتبط مباشرةً بتلك الخلايا التائية. تم تحسين هذا المنتج للاستخدام مع مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™ (رقم الكتالوج 552311)، ويحتوي على كمية كافية من الكواشف لوضع علامات على 1× 10E9 من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC). يحتوي مزيج إثراء الخلايا التائية الساذجة CD4+ البشرية على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التالية: بيوتين فأر مضاد لـ CD8 البشري، المستنسخ SK1؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD11b البشري، المستنسخ ICRF44؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD16 البشري، المستنسخ 3G8؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD19 البشري، المستنسخ HIB19؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD36 البشري، المستنسخ CB38؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD41a البشري، المستنسخ HIP8؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD45RO البشري، المستنسخ UCHL1؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD56 البشري، المستنسخ B159؛ بيوتين فأر مضاد لـ CD123 البشري، المستنسخ 9F5؛ بيوتين فأر مضاد لـ γδ-TCR البشري، المستنسخ B1؛ بيوتين فأر مضاد لـ Glycophorin A البشري، المستنسخ GA-R2
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالبيوتين في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة البيوتين غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد أو الستربتافيدين بالجسيمات المغناطيسية في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد/الستربتافيدين غير المرتبط.
إجراءات الفحص الموصى بها: فيما يلي بروتوكول الوسم المغناطيسي والإثراء المفصل. باختصار، يقوم مزيج إثراء الخلايا التائية المساعدة CD4+ البشرية الساذجة بتلوين كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية ومعظم كريات الدم البيضاء باستثناء الخلايا التائية المساعدة CD4+ الساذجة. بعد غسل الأجسام المضادة الزائدة، تُضاف جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM إلى معلق الخلايا، حيث ترتبط بالخلايا الحاملة للأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين. ثم يُوضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا الموسوم داخل المجال المغناطيسي لجهاز فصل الخلايا المغناطيسي BD IMag™ (رقم المنتج 552311). بعد ذلك، تُجرى عملية اختيار سلبي لإثراء الخلايا التائية المساعدة CD4+ الساذجة غير الموسومة. تهاجر الخلايا الموسومة نحو المغناطيس (الجزء الموجب)، تاركةً الخلايا غير الموسومة في المعلق ليتم سحبها والاحتفاظ بها (الجزء المُثرى). تُكرر عملية الاختيار السلبي مرتين لزيادة كمية الجزء المُثرى. في حال الحاجة إلى نقاء أعلى، يمكن إجراء عملية فصل سلبي على الجزء المُخصب. ولتوضيح الإجراء، تم رسم خطوات الفصل المغناطيسي في مخطط انسيابي للتخصيب. يمكن تقييم الأجزاء الموجبة والمُخصبة في تطبيقات لاحقة مثل قياس التدفق الخلوي وزراعة الأنسجة. تم تحسين الأجسام المضادة المُؤشَّرة بالبيوتين في كوكتيل تخصيب الخلايا التائية الساذجة CD4+ البشرية وتخفيفها مسبقًا لتوفير أقصى كفاءة لتخصيب الخلايا التائية الساذجة CD4+ من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي. بروتوكول الوسم المغناطيسي والتخصيب: 1. تحضير محلول BD IMag™ بتركيز 1X: خفف محلول BD IMag™ (10X) (رقم المنتج 552362) بنسبة 1:10 باستخدام ماء مقطر معقم أو حضّر محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات (PBS) مُدعَّم بـ 0.5% من ألبومين المصل البقري (BSA) و2 ملي مول من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) و0.1% من أزيد الصوديوم. ٢. حضّر الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم البشري المعالج بمضادات التخثر، ويفضل استخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول فيكول-باك™.* ٣. عدّ الخلايا، وأعد تعليقها في محلول BD IMag™ بتركيز ٥٠×١٠⁶ خلية/مل. ٤. أضف ٥ ميكرولتر من مزيج إثراء الخلايا التائية المساعدة CD4+ البشرية الساذجة لكل ١×١٠⁶ خلية، وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ١٥ دقيقة.† ٥. اغسل الخلايا الموسومة بعشرة أضعاف حجم محلول BD IMag™ بتركيز ١×، ثم اطردها مركزيًا عند ٣٠٠ × g لمدة ١٠ دقائق، واسحب السائل الطافي بالكامل بعناية. ٦. رجّ جزيئات BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM جيدًا، وأعد تعليق الخلايا المترسبة في ٧.٥ ميكرولتر من الجزيئات لكل ١×١٠⁶ خلية. يرجى ملاحظة أن حجم جزيئات IMag Streptavidin هذه أكبر من الحجم المستخدم في معظم مجموعات إثراء BD IMag، وأن هذه المجموعة تحتوي على حجم إجمالي أكبر من هذه الجزيئات لتعويض هذا الاختلاف. 7. اخلط جيدًا. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.† 8. ارفع حجم الوسم إلى تركيز من 10 إلى 80 × 10⁶ خلية/مل باستخدام محلول BD IMag™ المخفف 1X. 9. انقل الخلايا الموسومة إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير 12 × 75 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 1.0 مل. ضع أنبوب الجزء الموجب هذا على مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™ (في الوضع الأفقي) لمدة 6 إلى 8 دقائق. • للحصول على حجم أكبر، قسّم الخلايا إلى عدة أنابيب اختبار ذات قاع مستدير 12 × 75 مم أو انقلها إلى أنبوب اختبار ذي قاع مستدير 17 × 100 مم، بحيث لا يتجاوز الحجم المضاف 3.0 مل. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™ (في الوضع الرأسي) لمدة 8 دقائق. 10. مع بقاء الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وباستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، اسحب السائل الطافي (الجزء المُخصب) بعناية وضعه في أنبوب معقم جديد. 11. أزل أنبوب الجزء الموجب من مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™، وأضف محلول BD IMag™ بتركيز 1X إلى نفس الحجم كما في الخطوة 8. أعد تعليق الجزء الموجب جيدًا عن طريق السحب والدفع بالماصة من 10 إلى 15 مرة (مع تجنب تكوين فقاعات)، ثم أعد الأنبوب إلى مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™ لمدة 6 إلى 8 دقائق. • بالنسبة للأنبوب 17×100 مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™ لمدة 8 دقائق. ١٢. باستخدام ماصة باستور معقمة جديدة، اسحب السائل الطافي بحرص واخلطه مع الجزء المُخصب من الخطوة ١٠ أعلاه. ١٣. كرر الخطوتين ١١ و١٢. يحتوي الجزء المُخصب المُدمج على خلايا CD4+ ساذجة خالية من الأجسام المضادة أو الجسيمات المغناطيسية. ١٤. لزيادة نقاء الجزء المُخصب المُدمج، ضع الأنبوب الذي يحتوي عليه على مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™ لمدة تتراوح بين ٣ و١٠ دقائق إضافية. زيادة مدة المغناطيس ستزيد النقاء ولكنها ستُقلل من الاستخلاص. • للأنبوب ١٧×١٠٠ مم: ضعه على مغناطيس فصل الخلايا BD IMag™ لمدة ٦ دقائق. ١٥. اسحب السائل الطافي بحرص وضعه في أنبوب معقم جديد. هذا هو جزء خلايا CD4+ الساذجة المُخصب مرتين. الخلايا جاهزة للمعالجة في التطبيقات اللاحقة. ١٦. يمكن إعادة تعليق الخلايا المتبقية في الجزء الموجب في الأنبوب الأصلي في محلول منظم أو وسط زراعة مناسب للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، إذا لزم الأمر. ١٧. يجب تحليل عينات من معلق الخلايا الكلي، والأجزاء الموجبة والمُخصبة، باستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة عملية فصل الخلايا. ملاحظات: * نصائح لتحضير الخلايا بنجاح: • اسحب الدم في أنبوب يحتوي على EDTA. • أزل البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة عند ٢٢٠-٢٤٠ × g. • اغسل ٢-٣ مرات في محلول PBS بعد فصل التدرج الكثافي. • بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا بتركيز عالٍ نسبيًا في محلول BD IMag™ بتركيز ١X، ثم انتقل إلى الخطوة ٣. † تجنب الوسم غير المحدد بالعمل بسرعة والالتزام بأوقات الحضانة الموصى بها.
إشعارات المنتج: تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية في الولايات المتحدة. فيكول-باك علامة تجارية مسجلة لشركة أميرشام للعلوم الحيوية المحدودة. تُحضّر جزيئات BD IMag™ من جزيئات مغناطيسية مُعدّلة وظيفيًا بمجموعة الكربوكسيل، تُصنّعها شركة سكولد تكنولوجي، وهي مرخصة بموجب براءة الاختراع الأمريكية رقم 7,169,618. يُرجى زيارة http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS). يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.
الوصف: معرف EntrezGene
غير متاح : غير متاح