BD، 558534، مجموعة BD OptEIA™ Mouse TNF ELISA Set II

التفاعل: الفأر (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869215
الوصف: تحتوي مجموعة OptEIA™ لعامل نخر الورم (TNF) في الفئران على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لعامل نخر الورم الطبيعي أو المُعاد تركيبه في مصل الدم والبلازما وسوائل مزارع الخلايا. تُوفّر المجموعة مواد كافية لتحضير ما يقارب 20 صفيحة من 96 بئرًا، وذلك باتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموضحة في هذه العبوة. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA تصميمًا مرنًا للفحص بما يتناسب مع احتياجات كل مختبر. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: الالتقاط، معايرة الأجسام المضادة للكشف، وقت الحضانة، درجة حرارة الحضانة، تركيبة مخفف الفحص، درجة حموضة المحلول المنظم، القوة الأيونية، تركيز البروتين، نوع الركيزة، تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع). المعايرة: تتم معايرة هذا الفحص المناعي مقابل عامل نخر الورم الفأري المؤتلف النقي المُعبر عنه بواسطة فيروس باكولوفيروس أثناء تطوير المنتج.
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات الفحص الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف الفحص، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية: كربونات الصوديوم 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ 7.13 غرام من بيكربونات الصوديوم، 3.56 غرام من كربونات الصوديوم؛ يُكمل الحجم إلى 1.0 لتر؛ درجة الحموضة إلى 9.5. يُحضّر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف الفحص: محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة حتى 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُعطَّل بالحرارة). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول الغسل - محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات* مع 0.05% توين-20. يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 4. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يوصى باستخدام مجموعة كواشف BD Pharmingen™ TMB Substrate Reagent Set (رقم المنتج 555214). 5. محلول الإيقاف - 1 مولار H3PO4 أو 2 مولار H2SO4. المواد الإضافية المطلوبة: 1. يوصى باستخدام صفائح BD Falcon™ ELISA ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح دقيقة قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة بيانات آلية. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو غشاء بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. السائل الطافي لمزارع الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل، واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. البلازما: اجمع البلازما باستخدام السترات أو EDTA أو الهيبارين كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g خلال 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد تسخين المعيار المجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المحلول القياسي المجفف بالتجميد بإضافة 1.0 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول قياسي مركز. دوّن كمية البروتين الموضحة على ملصق قارورة المحلول القياسي المجفف بالتجميد، وسجّل تركيز المحلول القياسي المُعاد تكوينه أدناه لاستخدامه لاحقًا. اترك المحلول القياسي حتى يصل إلى حالة التوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّ القارورة برفق باستخدام جهاز الرجّ. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: بعد إعادة التكوين، قسّم المحلول القياسي المركز فورًا إلى حصص في قوارير بولي بروبيلين مُعلّمة بتركيز البروتين الصحيح، بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّنها عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمها إلى حصص/تجميدها. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة. 3. تحضير المحاليل القياسية للتحليل: أ. حضّر محلولًا قياسيًا بتركيز 1000 بيكوغرام/مل من المحلول القياسي المركز. رجّ القارورة برفق باستخدام جهاز الرجّ. ب. أضف 300 ميكرولتر من مخفف المعايرة إلى 6 أنابيب. ضع عليها علامات: 500 بيكوغرام/مل، 250 بيكوغرام/مل، 125 بيكوغرام/مل، 62.5 بيكوغرام/مل، 31.3 بيكوغرام/مل، و15.6 بيكوغرام/مل. إجراء المعايرة بالتفصيل: 1. خفف الجسم المضاد المُثبِّت بنسبة 1:250 في محلول التغطية، ثم غطِّ كل بئر من الآبار الدقيقة بـ 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المُثبِّت المخفف. أغلق الصفيحة بإحكام، ثم حضِّنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. لا تُخفِّف كمية من الجسم المضاد المُثبِّت أكثر من اللازم لتجربتك. 2. اسحب المحلول من الآبار، ثم اغسلها 3 مرات باستخدام 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة، ثم جففها بورق ماص لإزالة أي بقايا من المحلول. 3. قم بتغطية الصفائح بـ 200 ميكرولتر أو أكثر من مخفف الفحص لكل بئر. حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 4. اسحب المحلول واغسل الصفائح كما في الخطوة 2. 5. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف الفحص. راجع قسم تحضير المعايير والتعامل معها. تأكد من تسجيل تركيز المعيار المُعاد تكوينه لاستخدامه لاحقًا. 6. اسحب 100 ميكرولتر من كل معيار وعينة وعينة تحكم باستخدام ماصة وضعها في الآبار المناسبة. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 7. اسحب المحلول واغسل الصفائح كما في الخطوة 2، ولكن مع 5 عمليات غسل إجمالًا. 8. خفف جسم الكشف المضاد بنسبة 1:250 في مخفف الفحص، وأضف 100 ميكرولتر من جسم الكشف المضاد المخفف إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لا تخفف جسم الكشف المضاد أكثر من اللازم لتجربتك. ٩. اسحب السائل/اغسل كما في الخطوة ٢، ولكن بإجمالي ٥ غسلات. ١٠. خفف كاشف الإنزيم (SAv-HRP) بنسبة ١:٢٥٠ في مخفف الفحص، وأضف ١٠٠ ميكرولتر من كاشف الإنزيم المخفف إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تخفف كاشف الإنزيم أكثر من اللازم لتجربتك. ١١. اسحب السائل/اغسل كما في الخطوة ٢، ولكن بإجمالي ٧ غسلات. ملاحظة: في خطوة الغسل الأخيرة هذه، انقع الآبار في محلول الغسل لمدة ٣٠ ثانية إلى دقيقة واحدة لكل غسلة. ١٢. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول ركيزة TMB إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١٣. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. ١٤. اقرأ الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر خلال ٣٠ دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، فاطرح الامتصاص عند ٥٧٠ نانومتر من الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر. ملخص إجراء التحليل: ١. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر. حضّن طوال الليل عند ٤ درجات مئوية. ٢. اسحب المحلول واغسل ٣ مرات. ٣. صفائح الحجب: أضف ٢٠٠ ميكرولتر من مخفف التحليل إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ٤. اسحب المحلول واغسل ٣ مرات. ٥. أضف ١٠٠ ميكرولتر من المعيار أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ٦. اسحب المحلول واغسل ٥ مرات. ٧. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ٨. اسحب المحلول واغسل ٥ مرات. ٩. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول SAv-HRP المخفف إلى كل بئر. حضّن لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١٠. اسحب المحلول واغسله ٧ مرات (مع نقع لمدة ٣٠ ثانية إلى دقيقة واحدة). ١١. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول ركيزة TMB إلى كل بئر. حضّن لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١٢. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند ٤٥٠ نانومتر خلال ٣٠ دقيقة مع تصحيح الطول الموجي عند ٥٧٠ نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل منها. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع تركيز TNF على المحور السيني والامتصاص على المحور الصادي. ارسم منحنى أفضل مطابقة يمر بنقاط المعايرة. لتحديد تركيز عامل نخر الورم (TNF) في العينات المجهولة، ابحث عن متوسط ​​قيمة الامتصاص للعينة على المحور الصادي، وارسم خطًا أفقيًا يصل إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا يصل إلى المحور السيني، واقرأ تركيز عامل نخر الورم. إذا كانت العينات مخففة، اضرب تركيز عامل نخر الورم في معامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام تحليل الانحدار اللوغاريتمي (log-log) لتقليل البيانات باستخدام الحاسوب. الخصوصية والتفاعل المتبادل: تم اختبار العوامل التالية في اختبار BD OptEIA™ عند تركيز ≥ 10 نانوغرام/مل، ولم يتم رصد أي تفاعل متبادل (قيمة ≥ 15 بيكوغرام/مل). الإنسان المؤتلف: TNF الفأر المؤتلف: IL-1α، IL-1β، IL-2، IL-3، IL-4، IL-5، IL-6، IL-7، IL-9، IL-10، IL-12p70، IL-13، IL-15، IL-17، IL-18، GM-CSF، IFN-γ، LT-α، MCP-1، M-CSF، MIG، MIP-1α، MIP-1β، sTNFRI، sTNFRII، RANTES Recombinant Rat: IL-1α، IL-2، IL-4، IL-6، IL-10، IL-18، GM-CSF، IFN-γ قيود الإجراء - العينات التي تولد قيم امتصاص أعلى من المنحنى القياسي يجب تخفيفها بالمعيار القياسي مخفف و أُعيد اختبارها. - لم يتم التحقق بدقة من تداخل نواتج أيض الدواء، أو المستقبلات الذائبة، أو البروتينات الرابطة الأخرى في العينات. ولا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. - صُممت مجموعات BD OptEIA للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مجموعات مختلفة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو البروتينات الرابطة الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج عن أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات اللجنة الوطنية لمعايير المختبرات السريرية (NCCLS) لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر