BD، 558535، مجموعة BD OptEIA™ Rat TNF ELISA

التفاعل: الفئران (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869216
الوصف: تحتوي مجموعة OptEIA™ لعامل نخر الورم (TNF) في الفئران على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لعامل نخر الورم الطبيعي أو المُعاد تركيبه في مصل الدم والبلازما وسوائل مزارع الخلايا. تُوفّر المجموعة مواد كافية لتحضير ما يقارب 20 صفيحة من 96 بئرًا، وذلك باتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموصى بها والمحددة في هذه العبوة. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA تصميمًا مرنًا للفحص بما يتناسب مع احتياجات كل مختبر. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: الالتقاط، الكشف، معايرة الأجسام المضادة، وقت الحضانة، درجة حرارة الحضانة، الرقم الهيدروجيني للمحلول المنظم، القوة الأيونية، تركيز البروتين، نوع الركيزة، تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع). المعايرة: تتم معايرة هذا الفحص المناعي مقابل عامل نخر الورم الفأري المؤتلف النقي المعبر عنه بواسطة فيروس باكولوفيروس أثناء تطوير المنتج.
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف التحليل، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية: كربونات الصوديوم 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ أضف 7.13 غرام من بيكربونات الصوديوم، و3.56 غرام من كربونات الصوديوم؛ حتى يصل الحجم إلى 1.0 لتر؛ اضبط درجة الحموضة إلى 9.5. يُحضّر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف التحليل: محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة حتى 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُعطَّل بالحرارة). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول الغسل - محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات* مع 0.05% توين-20. يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، ويُخزَّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 4. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يوصى باستخدام مجموعة كواشف BD Pharmingen™ TMB Substrate Reagent Set (رقم المنتج 555214). 5. محلول الإيقاف: حمض الفوسفوريك 1 مولار أو حمض الكبريتيك 2 مولار. المواد الإضافية المطلوبة: 1. يوصى باستخدام صفائح BD Falcon™ ELISA ذات 96 بئرًا (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح دقيقة قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة آلية للبيانات. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو غشاء بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. السائل الطافي لمزارع الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل، واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. البلازما: اجمع البلازما باستخدام السترات أو EDTA أو الهيبارين كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g خلال 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد تسخين المعيار المجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المحلول القياسي المجفف بالتجميد بإضافة 1.0 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول قياسي مركز. دوّن كمية البروتين الموضحة على قارورة المحلول القياسي المجفف بالتجميد، وسجّل تركيز المحلول القياسي المُعاد تكوينه أدناه لاستخدامه لاحقًا. اترك المحلول القياسي حتى يصل إلى حالة التوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: بعد إعادة التكوين، قسّم المحلول القياسي المركز فورًا إلى حصص في قوارير بولي بروبيلين مُعلّمة بتركيز البروتين الصحيح، بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّنها عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمها إلى حصص/تجميدها. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة. 3. تحضير المحاليل القياسية للتحليل: أ. حضّر محلولًا قياسيًا بتركيز 2000 بيكوغرام/مل من المحلول القياسي المركز. رجّ المحلول برفق باستخدام جهاز الرجّ. ب. أضف 300 ميكرولتر من مخفف المعايرة إلى 6 أنابيب. ضع عليها ملصقات توضح تركيزاتها: 1000 بيكوغرام/مل، 500 بيكوغرام/مل، 250 بيكوغرام/مل، 125 بيكوغرام/مل، 62.5 بيكوغرام/مل، و31.3 بيكوغرام/مل. ج. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة بإضافة 300 ميكرولتر من كل معيار إلى الأنبوب التالي مع الخلط جيدًا بين كل عملية نقل. يُستخدم مخفف المعايرة كمعيار صفري (0 بيكوغرام/مل). إجراء المعايرة الموصى به: 1. خفف الجسم المضاد المُثبِّت بنسبة 1:250 في محلول التغطية، ثم غطِّ الآبار الدقيقة بـ 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المُثبِّت المخفف لكل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. لا تُخفف كمية من الجسم المضاد المُثبِّت أكثر من اللازم لتجربتك. ٢. اسحب المحلول من الآبار واغسلها ٥ مرات باستخدام ٣٠٠ ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة وجففها بورق ماص لإزالة أي محلول متبقٍ. ٣. أغلق الصفائح باستخدام ٢٠٠ ميكرولتر أو أكثر من مخفف المعايرة لكل بئر. حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ٤. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة ٢. ٥. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف المعايرة. راجع "تحضير المعايير والتعامل معها". تأكد من تسجيل تركيز المعيار المُعاد تكوينه لاستخدامه لاحقًا. ٦. ضع ١٠٠ ميكرولتر من كل معيار وعينة وعينة تحكم في الآبار المناسبة باستخدام ماصة. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ٧. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة ٢، ولكن مع ٥ غسلات إجمالًا. ٨. خفف الأجسام المضادة للكشف بنسبة ١:٢٥٠ في مخفف الفحص، وأضف ١٠٠ ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لا تخفف الأجسام المضادة للكشف أكثر من اللازم لتجربتك. ٩. اسحب/اغسل كما في الخطوة ٢، ولكن مع ٥ غسلات إجمالاً. ١٠. خفف كاشف الإنزيم (SAv-HRP) بنسبة ١:٢٥٠ في مخفف الفحص، وأضف ١٠٠ ميكرولتر من كاشف الإنزيم المخفف إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تخفف كاشف الإنزيم أكثر من اللازم لتجربتك. ١١. اسحب/اغسل كما في الخطوة ٢، ولكن مع ٧ غسلات إجمالاً. ملاحظة: في خطوة الغسل الأخيرة هذه، انقع الآبار في محلول الغسل لمدة ٣٠ ثانية إلى دقيقة واحدة لكل غسلة. ١٢. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء) لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١٣. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. ١٤. اقرأ الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر خلال ٣٠ دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، اطرح الامتصاص عند ٥٧٠ نانومتر من الامتصاص عند ٤٥٠ نانومتر. ملخص إجراء التحليل: ١. أضف ١٠٠ ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. حضّن طوال الليل عند ٤ درجات مئوية. ٢. اسحب المحلول واغسل ٥ مرات. ٣. صفائح الحجب: أضف ٢٠٠ ميكرولتر من مخفف التحليل إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ٤. اسحب المحلول واغسل ٥ مرات. ٥. أضف ١٠٠ ميكرولتر من المعيار أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ٦. اسحب المحلول واغسله ٥ مرات. ٧. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول الكشف المخفف إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ٨. اسحب المحلول واغسله ٥ مرات. ٩. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول SAv-HRP المخفف إلى كل بئر. حضّن لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١٠. اسحب المحلول واغسله ٧ مرات (مع نقع لمدة ٣٠ ثانية إلى دقيقة واحدة). ١١. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول ركيزة TMB إلى كل بئر. حضّن لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ١٢. أضف ٥٠ ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند ٤٥٠ نانومتر خلال ٣٠ دقيقة مع تصحيح الطول الموجي عند ٥٧٠ نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل منها. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع وضع تركيز عامل نخر الورم (TNF) على المحور السيني والامتصاصية على المحور الصادي. ارسم منحنى المطابقة الأمثل الذي يمر بنقاط المعايرة. لتحديد تركيز عامل نخر الورم (TNF) للعينات المجهولة، أوجد متوسط ​​قيمة الامتصاصية للعينات المجهولة على المحور الصادي، وارسم خطًا أفقيًا يصل إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا يصل إلى المحور السيني، واقرأ تركيز عامل نخر الورم (TNF). إذا كانت العينات مخففة، اضرب تركيز عامل نخر الورم (TNF) في معامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام تحليل الانحدار اللوغاريتمي لتقليل البيانات باستخدام الحاسوب. الخصوصية والتفاعل المتبادل: تم اختبار العوامل التالية في اختبار BD OptEIA عند تركيز ≥ 10 نانوغرام/مل، ولم يتم تحديد أي تفاعل متبادل (قيمة ≥ 15 بيكوغرام/مل). الإنسان المؤتلف: TNF الفأر المؤتلف: IL-1α، IL-1β، IL-2، IL-3، IL-4، IL-5، IL-6، IL-7، IL-9، IL-10، IL-12p70، IL-13، IL-15، IL-17، IL-18، GM-CSF، IFN-γ، LTα، MCP-1، M-CSF، MIG، MIP-1α، MIP-1β، sTNFRI، sTNFRII، RANTES Recombinant Rat: IL-1α، IL-2، IL-4، IL-6، IL-10، IL-18، GM-CSF، IFN-γ قيود الإجراء · يجب تخفيف العينات التي تولد قيم امتصاص أعلى من المنحنى القياسي بالمعيار القياسي مخفف و أُعيدَ التحليل. · لم يتم التحقق بدقة من تداخل مستقلبات الدواء، أو المستقبلات الذائبة، أو البروتينات الرابطة الأخرى في العينات. ولا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. · صُممت مجموعات BD OptEIA للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مجموعات مختلفة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات NCCLS لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر