BD، 558599، BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 488 Mouse anti-BrdU

الاسم البديل: 5-برومو-2'-ديوكسي يوريدين، 5-برومويوراسيل ديوكسي ريبوسيد، BUdR
النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
التطبيق: التصوير الحيوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_647075
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بصبغة أليكسا فلور® 488 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة صبغة أليكسا فلور® 488 غير المتفاعلة.
إجراءات الفحص الموصى بها: يتم وسم الخلايا بـ BrdU بشكل نبضي، ثم تثبيتها للحفاظ على كمية BrdU المحملة، ونفاذيتها لتلوين BrdU المدمج داخل النواة. يُستخدم إنزيم DNase I لقطع الحمض النووي بشكل عشوائي، مما يسمح للأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ BrdU بالارتباط بـ BrdU المدمج. المواد • مزرعة خلايا ملتصقة نامية في صفيحة تصوير Falcon™ ذات 96 بئرًا • حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية • BrdU (رقم المنتج 550891) مخفف إلى 10-100 ميكرومولار في وسط زراعة الأنسجة، حضّر كمية كافية للاستخدام بمقدار 50 ميكرولتر لكل بئر (انظر الخطوة 1 من الإجراء) • محلول تثبيت BD Cytofix™ (رقم المنتج 554655)، مُسخن إلى 37 درجة مئوية • محلول نفاذية BD Phosflow Perm Buffer III (رقم المنتج 558050)، عند -20 درجة مئوية • محلول ملحي مُخفف بالفوسفات (PBS)، في درجة حرارة الغرفة • محلول تلوين BD Pharmingen™ (FBS) (رقم المنتج 554656)، عند 4 درجات مئوية • محلول معقم من DNase I بتركيز 300 ميكروغرام/مل (مثلًا، Sigma-Aldrich، رقم المنتج 554656). • حضّر كمية كافية من محلول D4513 (في محلول PBS) بحجم 50 ميكرولتر لكل بئر. • حضّر كمية كافية من محلول Alexa 488 Mouse anti-BrdU أحادي النسيلة المخفف بنسبة 1:10 في محلول BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) بحجم 50 ميكرولتر لكل بئر. في حال استخدام أجسام مضادة إضافية، يجب إضافتها بحيث تشمل الكمية الإجمالية 50 ميكرولتر لكل بئر. • محلول هوكست 33342 بتركيز 2 ميكروغرام/مل (مثلًا، سيغما-ألدريتش، رقم المنتج B2261) في محلول ملحي فوسفاتي، حضّر كمية كافية لاستخدام 100 ميكرولتر لكل بئر. • جهاز تصوير فلوري قادر على إثارة ألكسا فلور® 488 وهوكست 33342، مثل نظام التصوير الحيوي BD Pathway™. الإجراء 1: حضّر مزارع الخلايا الملتصقة بإضافة 50 ميكرولتر من محلول بروموديوكسي يوريدين المخفف إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية. لا تُضِف بروموديوكسي يوريدين إلى الآبار التي ستُستخدم كضوابط سلبية لتلوين بروموديوكسي يوريدين. في جميع الخطوات اللاحقة، يجب معالجة الخلايا المحملة ببروموديوكسي يوريدين والخلايا الضابطة بالتوازي. ٢. أزل الوسط من الآبار، وثبّت الخلايا بإضافة ١٠٠ ميكرولتر من محلول التثبيت المُسخّن مسبقًا إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة ٢٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٣. أزل المُثبّت من الآبار، واغسلها مرتين بـ ١٠٠ ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي (PBS). ٤. أزل محلول الفوسفات الملحي (PBS)، واجعل الخلايا نفاذة بإضافة ١٠٠ ميكرولتر من محلول BD™ Phosflow Perm Buffer III البارد إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ٥. أزل محلول Perm Buffer III من الآبار، واغسلها مرتين بـ ١٠٠ ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي (PBS). ٦. أزل محلول الفوسفات الملحي (PBS)، واحجب الخلايا بإضافة ١٠٠ ميكرولتر من محلول BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ٧. أزل محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS)، وقم بتفكيك الحمض النووي للخلايا بإضافة ٥٠ ميكرولتر من محلول DNase I المعقم إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة ساعة واحدة عند ٣٧ درجة مئوية. ٨. أزل محلول DNase I من الآبار، واغسلها مرة واحدة بـ ١٠٠ ميكرولتر من محلول PBS. ٩. أزل محلول PBS، وقم بتلوين الخلايا بإضافة ٥٠ ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة إلى كل بئر، ثم حضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ١٠. أزل محلول الأجسام المضادة، واغسل الآبار مرتين بـ ١٠٠ ميكرولتر من محلول PBS. ١١. أزل محلول PBS، وقم بتلوين النوى بشكل معاكس بإضافة ١٠٠ ميكرولتر من محلول Hoechst 33342 إلى كل بئر قبل التصوير بـ ١٥ دقيقة على الأقل. ١٢. اعرض الخلايا وحللها باستخدام جهاز تصوير مناسب.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار عند اتباع إجراء الفحص الموصى به. يتكون الاختبار عادةً من حوالي 10000 خلية مزروعة في بئر من صفيحة تصوير ذات 96 بئرًا. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد في الماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. Alexa Fluor® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. تُباع مقترنات الأجسام المضادة المصبوغة بصبغات Alexa Fluor® و Pacific Blue™ و Cascade Blue® في هذا المنتج بموجب ترخيص من شركة Molecular Probes, Inc. للاستخدام البحثي فقط، باستثناء استخدامها مع المصفوفات الدقيقة، أو ككواشف خاصة بالمادة المراد تحليلها. تخضع أصباغ Alexa Fluor® (باستثناء Alexa Fluor® 430)، وصبغة Pacific Blue™، وصبغة Cascade Blue® لبراءات اختراع قيد الانتظار وصادرة. يتم جمع انبعاث الفلوركروم Alexa Fluor® 488 باستخدام نفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع إيزوثيوسيانات الفلورسين (FITC). يرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.