BD، 559064، BD Pharmingen™ مضاد TNF نقي للفئران

الاسم البديل: تنف؛ تنفا؛ تنف ألفا؛ تنف-أ؛ Tnfsf1a; Tnfsf2; TNFSF2؛ كاشكتين. ديف
التفاعل: الفأر (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المصلي: IgG1 للفئران
المستضد: عامل نخر الورم الفأري المؤتلف
التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)، الكيمياء المناعية الخلوية (يتم اختبارها أثناء التطوير)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_2271896
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب.
إجراءات الفحص الموصى بها: الفحص المناعي الخلوي: يمكن استخدام صيغة الفحص المناعي الخلوي (ICC) للأجسام المضادة MP6-XT22 النقية (رقم المنتج 559064) لتحديد وحصر الخلايا المنتجة لعامل نخر الورم (TNF) باستخدام الفحص المناعي الخلوي. وللحصول على أفضل تلوين مناعي خلوي غير مباشر، يجب معايرة الأجسام المضادة MP6XT22 (≤ 1 ميكروغرام) وتصويرها من خلال إجراء تلوين من ثلاث خطوات باستخدام بيوتين ماعز مضاد للفئران IgG وستربتافيدين بيروكسيداز الفجل (HRP). يوجد بروتوكول مفصل لهذا الإجراء أدناه. وللكشف الأمثل عن الخلايا المنتجة للسيتوكينات، يُفضل استخدام بيروكسيداز الفجل كنظام إنزيمي. بروتوكول الكيمياء المناعية الخلوية للسيتوكينات - الكواشف المطلوبة: 1. محلول التثبيت: محلول تثبيت BD Pharmingen™ ICC (رقم المنتج 550010 من BD) أو الفورمالين 5% (فورمالين 10%، CMS، رقم المنتج 245-684) مُذاب في محلول ملحي مُخفف بالفوسفات (PBS) (محلول Bacto FA، مختبرات Difco، رقم المنتج 2314-15-0). 2. محلول حجب البيروكسيداز الداخلي: كاشف حجب البيروكسيداز DAKO (DAKO، رقم المنتج S2001). 3. محلول حجب البيوتين الداخلي: مجموعة حجب البيوتين/أفيدين (مختبرات Vector، رقم المنتج SP-2001). 4. محلول تخفيف الأجسام المضادة: مُخفف الأجسام المضادة BD Pharmingen™ للكيمياء المناعية الخلوية، رقم المنتج 1000. رقم 559148، مُدعّم بالصابونين 5. شرائح مجهرية: شرائح لاصقة (شركة إيري ساينتيفيك، رقم المنتج ER-202B-AD) أو شرائح كولورفروست/بلس (فيشر، رقم المنتج 12-550-17) للتحضير الخلوي. 6. بيوتين ماعز مضاد لـ IgG الفأر (رقم المنتج 559286)، أو مجموعة الكشف عن Ig الفأر باستخدام HRP (رقم المنتج 551013). 7. نظام الكشف: BD Pharmingen™ ستربتأفيدين-HRP (رقم المنتج 550946)، أو مجموعة الكشف عن Ig الفأر باستخدام HRP (رقم المنتج 551013). 8. وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل: أكوا-ماونت® (مختبرات ليرنر، رقم المنتج 13800). ٩. مجموعة ركيزة DAB (تحتوي على 3،3-ثنائي أمينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد)، (رقم المنتج من BD: 550880)، أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة للفئران Ig HRP (رقم المنتج: 551013). إجراء التلوين المناعي الخلوي لتحضيرات الخلايا المفردة: يصف هذا الإجراء تقنية التلوين المناعي الإنزيمي للسيتوكينات داخل الخلايا المفردة المثبتة على شرائح مجهرية عن طريق الالتصاق (الشرائح اللاصقة) أو الطرد المركزي (الشرائح الخلوية). الشرائح اللاصقة: 1. تُجمع الخلايا وتُغسل مرتين في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) باستخدام الطرد المركزي (400 × جم لمدة 5 دقائق) لإزالة البروتين المتبقي. 2. يُضبط تركيز الخلايا عند 4-5 × 10⁶ خلية/مل في محلول ملحي فوسفاتي (PBS). 3. ضع 20 ميكرولتر من معلق الخلايا في كل بئر من شرائح الالتصاق، واتركها تلتصق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. يُرجى ملاحظة أنه يجب غسل الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل نقل الخلايا. 4. ثبّت الخلايا على الشرائح باستخدام محلول التثبيت (رقم المنتج 550010) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 5. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق لكل مرة. 6. احجب الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) المُضاف إليه 1% (وزن/حجم) من ألبومين المصل البقري (BSA) (سيجما، رقم المنتج A43-78) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. 7. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) ثم تابع عملية التلوين، أو جففها بالهواء واحفظها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا. ٨. حضّن الشرائح مع ٢٠ ميكرولتر من مصل الماعز بتركيز ١٪ ومحلول فوسفات ملحي (PBS) مع ٠٫١٪ (وزن/حجم) من الصابونين لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٩. اغسل الشرائح مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٠. احجب نشاط البيروكسيداز الداخلي باستخدام محلول حجب البيروكسيداز الداخلي (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ١١. اغسل مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٢. حضّن كل بئر مع الأفيدين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. ١٣. اغسل مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٤. حضّن كل بئر مع البيوتين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. ١٥. اغسل مرتين بمحلول فوسفات ملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٦. حضّن كل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع ٢٠ ميكرولتر من الأجسام المضادة النقية الخاصة بالسيتوكين أو نظير الغلوبولين المناعي المناسب كعنصر تحكم، مخففًا في محلول تخفيف IHC من Pharmingen (رقم المنتج ٥٥٩١٤٨)، مع إضافة الصابونين. ١٧. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٨. حضّن كل بئر مع ٢٠ ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المبيوتينية المخففة في محلول تخفيف IHC لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ١٩. اغسل مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٢٠. ضع ٢٠ ميكرولتر من ستربتأفيدين-HRP (رقم المنتج ٥٥٠٩٤٦ من BD) على كل بئر في الشرائح وحضّن لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٢١. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٢٢. حضّن الشرائح مع ركيزة DAB وفقًا للتعليمات (BD Cat. No. 550880) لمدة تقل عن ٥ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ٢٣. أوقف تفاعل اللون بالغسل بمحلول PBS. ٢٤. تُثبّت الشرائح بعد ذلك في وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل. أجهزة الطرد المركزي CYTOSPINS: ١. جهّز حجرة عينة جهاز الطرد المركزي Cytospin (مثل Cytospin 3، Shandon، المملكة المتحدة أو جهاز طرد مركزي مماثل)، وبطاقة الترشيح، والشرائح، وحامل جهاز الطرد المركزي Cytospin وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة. ٢. ضع ٤٠ ميكرولتر من حوالي ١ × ١٠⁶ خلية في كل حجرة عينة. ٣. قم بتدوير الشرائح بسرعة ٦٠٠ دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. ٤. أخرج الشرائح من حامل جهاز الطرد المركزي Cytospin وضعها على حامل التلوين. ٥. للتثبيت والتلوين، يُرجى اتباع الخطوات من ٤ إلى ٢٤ المذكورة أعلاه لتلوين الخلايا على شرائح الالتصاق.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. يجب تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يُعد أزيد الصوديوم مثبطًا عكسيًا لعملية الأيض التأكسدي؛ لذلك، يجب عدم استخدام مستحضرات الأجسام المضادة التي تحتوي على هذه المادة الحافظة في مزارع الخلايا أو حقنها في الحيوانات. يمكن إزالة أزيد الصوديوم عن طريق غسل الخلايا المصبوغة أو الأجسام المضادة المرتبطة بالصفيحة أو عن طريق غسيل الأجسام المضادة الذائبة في محلول منظم خالٍ من أزيد الصوديوم. نظرًا لأن السموم الداخلية قد تؤثر أيضًا على نتائج الدراسات الوظيفية، فإننا نوصي باستخدام صيغة الأجسام المضادة NA/LE (خالية من الأزيد/منخفضة السموم الداخلية)، إن وجدت، للاستخدام في المختبر وفي الجسم الحي. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.