BD، 559072، BD Pharmingen™، جسم مضاد IgG1 نقي من الفئران، κ، عنصر تحكم متماثل النمط

الاسم البديل: عنصر تحكم من نوع IgG1 kappa
النمط المصلي: IgG1، كابا للفئران
المستضد: الغلوبولين المناعي للفأر
التطبيق: معيار ELISA، قياس التدفق الخلوي، التحكم في النمط المتماثل (يتم اختباره بشكل روتيني)، الكيمياء المناعية النسيجية - الفورمالين (يلزم استرجاع المستضد)، الكيمياء المناعية النسيجية - المجمدة، الكيمياء المناعية النسيجية - المثبتة بالزنك (يتم اختبارها أثناء التطوير)
التركيز: 0.5 ملغم/مل
RRID: AB_397192
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على ≤0.09% من أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي بواسطة كروماتوغرافيا التقارب.
إجراءات الفحص الموصى بها: إجراءات الفحص الموصى بها - الكيمياء المناعية الخلوية: يُنصح الباحثون بأن هذا المنتج النقي لا يُختبر بشكل روتيني باستخدام تقنية الكيمياء المناعية الخلوية (الشرائح الخلوية). هذه المادة عبارة عن عنصر تحكم مناعي من نوع الغلوبولين المناعي IgG1 للفئران، ويمكن استخدامها لتحديد مستوى التلوين الخلفي غير النوعي في فحص الكيمياء المناعية الخلوية غير المباشر للسيتوكينات. يجب استخدام الجسم المضاد R3-34 النقي بنفس تركيز الجسم المضاد النوعي الأولي، وتصويره في ظل نفس الظروف من خلال إجراء تلوين من ثلاث خطوات بالاشتراك مع الجسم المضاد IgG المضاد للفئران من الماعز والمُعلَّم بالبيوتين (رقم المنتج 559286) ونظام الكشف باستخدام الأفيدين أو الستربتافيدين-بيروكسيداز الفجل (رقم المنتج 550946). بروتوكول التلوين المناعي الخلوي للسيتوكينات: يصف هذا الإجراء تقنية التلوين المناعي الإنزيمي للسيتوكينات داخل الخلايا الفردية المثبتة على شرائح مجهرية عن طريق الالتصاق (الشرائح اللاصقة) أو الطرد المركزي (الشرائح الخلوية). المواد الكيميائية المطلوبة: 1. محلول التثبيت: يُذاب 5% فورمالين (10% فورمالين، CMS، رقم المنتج 245-684) في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) (محلول Bacto FA، مختبرات Difco، رقم المنتج 2314-15-0)، أو محلول تثبيت BD Pharmingen™ ICC (BD، رقم المنتج 550010). 2. محلول حجب البيروكسيداز الداخلي: كاشف حجب البيروكسيداز DAKO (DAKO، رقم المنتج S2001). 3. محلول حجب البيوتين الداخلي: مجموعة حجب البيوتين/أفيدين (مختبرات فيكتور، رقم المنتج: SP-2001). 4. محلول تخفيف الأجسام المضادة: محلول تخفيف السيتوكينات ICC من BD Pharmingen™ مُدعّم بالصابونين (BD، رقم المنتج: 550009). 5. شرائح مجهرية: شرائح الالتصاق (شركة إيري ساينتيفيك، رقم المنتج: ER-202B-AD) أو شرائح Colorfrost /Plus (فيشر، رقم المنتج: 12-550-17) للتحضيرات الخلوية. 6. نظام الكشف: BD Pharmingen™ ستربتأفيدين-بيروكسيداز الفجل (HRP) (رقم المنتج: 550946)، أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة للفئران Ig HRP (رقم المنتج: 551013). ٧. وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل: Aqua-mount® (مختبرات ليرنر، رقم المنتج ١٣٨٠٠). ٨. مجموعة ركيزة DAB (تحتوي على ٣،٣-ثنائي أمينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد)، (BD رقم المنتج ٥٥٠٨٨٠)، أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة Ig للفئران بتقنية HRP (رقم المنتج ٥٥١٠١٣). الأجسام المضادة الثانوية: ١. جسم مضاد IgG للفئران من الماعز مع البيوتين (رقم المنتج ٥٥٩٢٨٦) أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة Ig للفئران بتقنية HRP (رقم المنتج ٥٥١٠١٣). ٢. جسم مضاد IgG للفئران من الماعز مع البيوتين (رقم المنتج ٥٥٠٣٣٧) أو مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة Ig للفئران بتقنية HRP (رقم المنتج ٥٥١٠١١). شرائح الالتصاق: 1. اجمع الخلايا واغسلها مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) باستخدام جهاز الطرد المركزي (400 × g لمدة 5 دقائق) لإزالة البروتين المتبقي. 2. اضبط تركيز الخلايا إلى 4-5 × 10⁶ خلية/مل في محلول الفوسفات الملحي (PBS). 3. ضع 20 ميكرولتر من معلق الخلايا في كل بئر من شرائح الالتصاق واتركها تلتصق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. يُرجى ملاحظة أنه يجب غسل الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل نقل الخلايا. 4. ثبّت الخلايا على الشرائح باستخدام محلول التثبيت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 5. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 6. احجب الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) المُضاف إليه 1% (وزن/حجم) من ألبومين المصل البقري (BSA) (سيجما، رقم المنتج A43-78) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ٧. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) ثم قم بتلوينها، أو جففها بالهواء واحفظها عند درجة حرارة -٨٠ درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا. ٨. حضّن الشرائح مع ٢٠ ميكرولتر من مصل الماعز بتركيز ١٪ ومحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع ٠٫١٪ (وزن/حجم) من الصابونين لمدة ٣٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٩. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٠. قم بتثبيط نشاط البيروكسيداز الداخلي باستخدام محلول تثبيط البيروكسيداز الداخلي (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ١١. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٢. حضّن كل بئر مع الأفيدين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. ١٣. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ١٤. حضّن كل بئر مع البيوتين (٢٠ ميكرولتر/بئر) لمدة ١٥ دقيقة. 15. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 16. حضّن كل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة النقية الخاصة بالسيتوكين أو نظير الغلوبولين المناعي المناسب كعنصر تحكم، مخففًا في محلول تخفيف السيتوكين ICC من Pharmingen والمُضاف إليه الصابونين. 17. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 18. حضّن كل بئر مع 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المُؤشَّرة بالبيوتين، مخففًا في محلول تخفيف السيتوكين ICC لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 19. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة 5 دقائق. 20. ضع 20 ميكرولتر من ستربتأفيدين-HRP (رقم المنتج 550946 من BD) على كل بئر في الشرائح، وحضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ٢١. اغسل الشرائح مرتين بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) مع حضانة لمدة ٥ دقائق. ٢٢. حضّن الشرائح مع ركيزة DAB وفقًا للتعليمات (BD Cat. No. 550880) لمدة أقل من ٥ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ٢٣. أوقف تفاعل اللون بالغسل بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). ٢٤. تُثبّت الشرائح بعد ذلك في وسط تثبيت للتخزين قصير الأجل. أجهزة الطرد المركزي الخلوي (CYTOSPINS): ١. جهّز حجرة عينة جهاز الطرد المركزي الخلوي (مثل Cytospin 3، Shandon، المملكة المتحدة أو جهاز طرد مركزي مماثل)، وبطاقة الترشيح، والشرائح، وحامل جهاز الطرد المركزي الخلوي وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة. ٢. ضع ٤٠ ميكرولتر من حوالي ١ × ١٠⁶ خلية في كل حجرة عينة. ٣. قم بتدوير الشرائح بسرعة ٦٠٠ دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. ٤. أخرج الشرائح من حامل جهاز الطرد المركزي الخلوي وضعها على حامل التلوين. 5. للتثبيت والتلوين، يرجى اتباع الخطوات من 4 إلى 24 المحددة أعلاه لتلوين الخلايا على شرائح الالتصاق.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يجب استخدام عينة تحكم متماثلة النمط بنفس تركيز الجسم المضاد المطلوب.