BD، 559268، مجموعة BD OptEIA™ ELISA البشرية IL-15

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: اختبار ELISA (يتم اختباره بشكل روتيني)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869260
الوصف: تحتوي مجموعة BD OptEIA™ الخاصة بالإنترلوكين-15 البشري على المكونات اللازمة لتطوير فحوصات الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للإنترلوكين-15 البشري الطبيعي أو المُعاد تركيبه في المصل والبلازما وسوائل مزارع الخلايا. تُوفّر المجموعة مواد كافية لتحضير ما يقارب 20 صفيحة من 96 بئرًا، شريطة اتباع تعليمات التخزين والمواد وتحضير المحلول المنظم وإجراء الفحص الموصى بها والمحددة في هذه العبوة. تحسين الفحص: تتيح مجموعات BD OptEIA™ تصميمًا مرنًا للفحص بما يتناسب مع احتياجات كل مختبر. لتصميم فحص مناعي بحساسية ونطاق ديناميكي مختلفين، يمكن تغيير المعايير التالية: معايرة الأجسام المضادة للالتقاط والكشف؛ درجة حرارة الحضانة؛ تركيبة مخفف الفحص؛ درجة حموضة المحلول المنظم، والقوة الأيونية، وتركيز البروتين؛ نوع الركيزة؛ تقنية الغسل (أي عدد مرات الغسل وأوقات النقع). المعايرة: تتم معايرة المعيار في هذه المجموعة مقابل إنترلوكين-15 البشري المؤتلف النقي المُعبَّر عنه بواسطة فيروسات الباكولو، والذي تم إنتاجه في شركة BD Biosciences Pharmingen.
التحضير والتخزين: تُحفظ الكواشف غير المفتوحة في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية. لا تستخدم الكواشف بعد تاريخ انتهاء الصلاحية، أو إذا ظهرت عليها عكارة. قبل الاستخدام، اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). بعد الاستخدام مباشرة، أعدها إلى ظروف التخزين المناسبة. تبقى المعايير المجففة بالتجميد مستقرة حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. بعد إعادة تكوين المحلول، قسّم المحلول القياسي مباشرةً إلى حصص في قوارير من البولي بروبيلين بمقدار 50 ميكرولتر لكل قارورة، ثم جمّدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا لزم الأمر، خزّن المحلول في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص وتجميده. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات التحليل الموصى بها: المحاليل المنظمة الموصى بها. ملاحظة: لا تستخدم أزيد الصوديوم في هذه التحضيرات. يُعطّل أزيد الصوديوم إنزيم بيروكسيداز الفجل. يُوصى باستخدام مجموعة كواشف BD OptEIA™ B (رقم المنتج 550534) التي تحتوي على محلول التغطية، ومخفف التحليل، وكواشف الركيزة A وB، ومحلول الإيقاف، ومحلول غسيل مركز 20X. 1. محلول التغطية: كربونات 0.1 مولار، درجة الحموضة 9.5؛ 8.40 غرام من بيكربونات الصوديوم، 3.56 غرام من كربونات الصوديوم؛ يُكمل الحجم إلى 1.0 لتر؛ درجة الحموضة إلى 9.5. يُحضّر طازجًا أو يُستخدم خلال 7 أيام من التحضير، ويُخزّن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 2. مخفف التحليل: محلول فوسفات ملحي* مع 10% مصل بقري جنيني#، درجة الحموضة 7.0. يُوصى باستخدام مُخفِّف اختبار BD Pharmingen™ (رقم المنتج 555213). *محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات: 80.0 غ كلوريد الصوديوم، 11.6 غ فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم، 2.0 غ فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم، 2.0 غ كلوريد البوتاسيوم، كمية كافية حتى 10 لترات؛ درجة الحموضة حتى 7.0. #مصل جنيني بقري: يُوصى باستخدام Hyclone رقم المنتج SH30088 (مُعطَّل بالحرارة). يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، مع التخزين في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 3. محلول الغسل - محلول ملحي مُخفَّف بالفوسفات* مع 0.05% توين-20. يُحضَّر طازجًا أو يُستخدم في غضون 3 أيام من التحضير، مع التخزين في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. 4. محلول الركيزة - رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وبيروكسيد الهيدروجين. يوصى باستخدام مجموعة كواشف BD Pharmingen™ TMB Substrate Reagent Set (رقم المنتج 555214). 5. محلول الإيقاف - 1 مولار H3PO4 أو 2 مولار H2SO4. المواد الإضافية المطلوبة: 1. صفائح الميكروويل؛ يوصى باستخدام صفائح BD Falcon™ ELISA (رقم المنتج 353279). 2. قارئ صفائح ميكروويل قادر على قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. 3. ماصات دقيقة. 4. أسطوانة مدرجة، سعة لتر واحد. 5. ماء منزوع الأيونات أو مقطر. 6. زجاجة غسيل أو غسالة آلية. 7. ورق رسم بياني لوغاريتمي أو معالجة بيانات آلية. 8. أنابيب لتحضير التخفيفات القياسية. 9. مؤقت مختبري. 10. أغطية صفائح أو بارافين. جمع العينات ومعالجتها: يجب أن تكون العينات صافية، وغير متحللة الدم، وغير دهنية. السائل الطافي لمزارع الخلايا: أزل أي مواد جسيمية بالطرد المركزي، ثم قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. المصل: استخدم أنبوب فصل المصل، واترك العينات تتخثر لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g. أزل المصل وقم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. البلازما: اجمع البلازما باستخدام السترات أو EDTA أو الهيبارين كمضاد للتخثر. قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × g خلال 30 دقيقة من الجمع. قم بإجراء التحليل فورًا أو خزّن العينات عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تحضير المعايير والتعامل معها: 1. إعادة التكوين: بعد التسخين إلى درجة حرارة الغرفة، افتح القارورة بحرص لتجنب فقدان المادة. أعد تكوين المعيار المجفف بالتجميد بإضافة 1.0 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على معيار أساسي. اترك المحلول القياسي ليستقر لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء التخفيفات. رجّه برفق باستخدام جهاز الرجّ. 2. تخزين/معالجة المحلول القياسي المُعاد تكوينه: بعد إعادة التكوين، قسّم المحلول القياسي المركز فورًا إلى حصص بحجم 50 ميكرولتر لكل أنبوب، ثم جمّده عند درجة حرارة ≤ -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. لا تترك المحلول القياسي المُعاد تكوينه في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر، خزّنه عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل تقسيمه إلى حصص/تجميده. 3. تحضير المحاليل القياسية للاختبار: أ. حضّر محلولًا قياسيًا بتركيز 500 بيكوغرام/مل من المحلول القياسي المركز. رجّه جيدًا باستخدام جهاز الرجّ. ب. أضف 300 ميكرولتر من مُخفّف الاختبار إلى 6 أنابيب. قم بتسمية العينات بالتركيزات التالية: 250 بيكوغرام/مل، 125 بيكوغرام/مل، 62.5 بيكوغرام/مل، 31.3 بيكوغرام/مل، 15.6 بيكوغرام/مل، و7.8 بيكوغرام/مل. ج. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة بإضافة 300 ميكرولتر من كل معيار إلى الأنبوب التالي مع الخلط جيدًا بين كل عملية نقل. يُستخدم مخفف المعايرة كمعيار صفري (0 بيكوغرام/مل). ملاحظة تحضير الكاشف العامل: حضانة كواشف البيوتين/ستربتافيدين في خطوة واحدة. أضف الحجم المطلوب من جسم الكشف المضاد إلى مخفف المعايرة. في غضون 15 دقيقة قبل الاستخدام، أضف الكمية المطلوبة من كاشف الإنزيم، ثم اخلط جيدًا. لتحضير 12 مل من الكاشف العامل للوحة 96 بئرًا كاملة. التحذيرات والاحتياطات: 1. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. ٢. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات اللجنة الوطنية لمعايير المختبرات السريرية (NCCLS) لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. ٣. يحتوي الجسم المضاد المُثبِّت على أقل من ٠.١٪ من أزيد الصوديوم. ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. ٤. يحتوي الجسم المضاد الكاشف على ١٪ من ألبومين المصل البقري (BSA) وProClin™-150 كمادة حافظة. ٥. يحتوي كاشف الإنزيم على ١٪ من ألبومين المصل البقري (BSA) وProClin™-300 كمادة حافظة. ٦. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) تقع في الولايات المتحدة. إجراء الفحص الموصى به: ١. غطِّ الآبار الدقيقة بـ ١٠٠ ميكرولتر لكل بئر من الجسم المضاد المُثبِّت المخفف في محلول التغطية. للاطلاع على التخفيف الموصى به لتغطية الجسم المضاد، راجع التعليمات/شهادة التحليل الخاصة بالدفعة. 1. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية. 2. اسحب المحلول من الآبار واغسلها 3 مرات باستخدام 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الغسل لكل بئر. بعد الغسلة الأخيرة، اقلب الصفيحة وجففها بورق ماص لإزالة أي محلول متبقٍ. 3. أغلق الصفيحة باستخدام 200 ميكرولتر أو أكثر من مخفف المعايرة لكل بئر. احضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. 4. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2. 5. حضّر تخفيفات المعيار والعينة في مخفف المعايرة. انظر "تحضير المعايير والتعامل معها". 6. ضع 100 ميكرولتر من كل معيار وعينة وعينة تحكم في الآبار المناسبة باستخدام ماصة. أغلق الصفيحة بإحكام واحضنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 7. اسحب المحلول واغسلها كما في الخطوة 2، ولكن مع 5 غسلات إجمالاً. 8. أضف 100 ميكرولتر من كاشف العمل المُحضر (جسم مضاد للكشف + كاشف SAv-HRP) إلى كل بئر. أغلق الصفيحة بإحكام وحضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 9. اسحب المحلول واغسل الصفيحة كما في الخطوة 2، ولكن مع 7 غسلات إجمالاً. ملاحظة: في خطوة الغسل الأخيرة هذه، انقع الآبار في محلول الغسل لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة لكل غسلة. 10. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن الصفيحة (بدون غطاء الصفيحة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 11. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. 12. اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر في غضون 30 دقيقة من إيقاف التفاعل. إذا كان تصحيح الطول الموجي متاحًا، فاطرح الامتصاص عند 570 نانومتر من الامتصاص عند 450 نانومتر. ملخص إجراء الفحص: 1. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. حضّن الصفيحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. 2. اسحب المحلول واغسل الصفيحة 3 مرات. 3. حجب الصفائح: أضف 200 ميكرولتر من مخفف الفحص إلى كل بئر. 4. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 5. اسحب المحلول واغسل 3 مرات. 6. أضف 100 ميكرولتر من المحلول القياسي أو العينة إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. 7. اسحب المحلول واغسل 5 مرات. 8. أضف 100 ميكرولتر من كاشف العمل (الكشف عن الأجسام المضادة + SAv-HRP) إلى كل بئر. حضّن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. 9. اسحب المحلول واغسل 7 مرات (مع نقع لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة). 10. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. حضّن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. 11. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. اقرأ عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة. تصحيح الطول الموجي 570 نانومتر. حساب النتائج: احسب متوسط ​​الامتصاص لكل مجموعة من المعايير المكررة، وعينات التحكم، والعينات. اطرح متوسط ​​امتصاص المعيار الصفري من كل منها. ارسم منحنى المعايرة على ورق رسم بياني لوغاريتمي، مع وضع تركيز IL-15 على المحور السيني والامتصاصية على المحور الصادي. ارسم منحنى المطابقة الأمثل الذي يمر بنقاط المعايرة. لتحديد تركيز IL-15 في العينات المجهولة، أوجد متوسط ​​قيمة الامتصاصية للعينة المجهولة على المحور الصادي، وارسم خطًا أفقيًا يصل إلى منحنى المعايرة. عند نقطة التقاطع، ارسم خطًا رأسيًا يصل إلى المحور السيني، واقرأ تركيز IL-15. إذا كانت العينات مخففة، اضرب تركيز IL-15 في معامل التخفيف. يمكن أيضًا استخدام تحليل الانحدار الخطي لتقليل البيانات باستخدام الحاسوب. الخصوصية والتفاعل المتبادل: تم اختبار العوامل التالية في اختبار OptEIA™ عند تركيز 10 نانوغرام/مل، ولم يتم تحديد أي تفاعل متبادل.
إشعارات المنتج: للحصول على تدريب عبر الإنترنت حول تقنيات ELISA لمجموعة BD OptEIA™، يُرجى الرجوع إلى الرابط التالي: http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml. يجب تخفيف العينات التي تُظهر قيم امتصاص أعلى من منحنى المعايرة باستخدام مُخفف المعايرة القياسي وإعادة تحليلها. لم يتم التحقق بشكل كامل من تداخل مستقلبات الأدوية أو المستقبلات الذائبة أو بروتينات الربط الأخرى في العينات. لا يمكن استبعاد احتمال حدوث تداخل. صُممت مجموعات BD OptEIA™ للاستخدام كوحدة متكاملة. لا تخلط الكواشف من دفعات مختلفة من المجموعة. لا يُنصح باستخدام كواشف من شركات مصنعة أخرى في هذه المجموعة. قد تكون الكواشف التي تحتوي على مواد حافظة سامة في حالة الابتلاع أو الاستنشاق أو ملامسة الجلد. تعامل مع جميع عينات المصل والبلازما وفقًا لإرشادات NCCLS لمنع انتقال العدوى المنقولة بالدم. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. ProClin هي علامة تجارية لشركة Rohm and Haas.
الوصف: الكمية/الحجم: رقم القطعة: معرف EntrezGene
غير متوفر : لا شيء : غير متوفر : غير متوفر