BD، 559934، BD Pharmingen™ Cy™5 Annexin V

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2869267
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ Cy™5 Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (Kd ~5 x 10e2) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط Cy™5 Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين Cy™5 Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام Cy™5 Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام Cy™5 Annexin V على خط خلوي (Jurkat). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 ملي مولار في DMSO. 2. خلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10⁶ خلية Jurkat. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. متابعة بروتوكول تلوين Cy™5 Annexin V لقياس موت الخلايا المبرمج. بروتوكول تلوين Cy™5 Annexin V: الكواشف: 1. Cy™5 Annexin V: مُضمَّن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. ٢. ٧-أمينو-أكتينوميسين د (٧-AAD): غير مُضمّن. ٧-AAD (رقم المنتج ٥٥٩٩٢٥) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم ٥ ميكرولتر لكل اختبار. ٣. محلول ربط ١٠X: غير مُضمّن. ٠.١ مولار هيبس (الأس الهيدروجيني ٧.٤)، ١.٤ مولار كلوريد الصوديوم، ٢٥ ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة ٤ درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء محلول ربط أنيكسين V، بتركيز ١٠X (رقم المنتج ٥٥٦٤٥٤). التلوين: ١. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط ١X بتركيز ١ × ١٠⁶ خلية/مل. ٢. انقل ١٠٠ ميكرولتر من المحلول (١ × ١٠⁵ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة ٥ مل. ٣. أضف ٥ ميكرولتر من Cy™5 Annexin V (للتحليل أحادي اللون وثنائي اللون) و٥ ميكرولتر من 7-AAD (للتحليل ثنائي اللون فقط). ٤. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة (٢٥ درجة مئوية) في الظلام. ٥. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول الربط ١X إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: يبلغ طول موجة انبعاث Cy™5 ٦٧٠ نانومتر، وطول موجة الإثارة ٦٢٥-٦٥٠ نانومتر. تم تحسين Cy5 لتألق FL4 على جهاز قياس التدفق الخلوي BD FACSCalibur™. بالنسبة لجهاز قياس التدفق الخلوي BD FACSVantage™، يُوصى باستخدام مرشح 675/20 للانبعاث. تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: 1. خلايا غير مصبوغة. 2. خلايا مصبوغة بـ Cy™5 Annexin V فقط (بدون 7-AAD). 3. خلايا مصبوغة بـ 7-AAD فقط (بدون Cy™5 Annexin V). ضوابط صبغ أخرى: يجب استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على صبغ تحكم إيجابي باستخدام Cy™5 Annexin V و/أو Cy™5 Annexin V و7-AAD. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المُحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (Cy™5 Annexin V إيجابي، 7-AAD سلبي أو Cy™5 Annexin V إيجابي، 7-AAD إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا الميتة والخلايا التي تخضع للاستماتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي حُثّت على الخضوع للاستماتة بطرح نسبة الخلايا الميتة في المجموعة غير المعالجة من نسبة الخلايا الميتة في المجموعة المعالجة. ولأن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة ستكون ذات غشاء تالف وستُظهر تفاعلًا إيجابيًا مع كل من 7-AAD وCy™5 Annexin V. وبالتالي، لا يُميّز هذا الاختبار بين الخلايا التي خضعت بالفعل للاستماتة وتلك التي ماتت نتيجةً لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستُظهر الخلايا الميتة تفاعلًا إيجابيًا مع كل من Cy™5 Annexin V و7-AAD.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Cy هي علامة تجارية لشركة GE Healthcare. قبل التلوين بهذا الكاشف، يرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.