BD، 560088، BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 647 Mouse anti-Human IFN-α[2b]

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
المستضد: إنترفيرون ألفا 2ب البشري
التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 20 ميكرولتر
RRID: AB_1645416
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بصبغة أليكسا فلور® 647 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة صبغة أليكسا فلور® 647 غير المتفاعلة.
إجراءات الفحص الموصى بها: يرجى الرجوع إلى الجدول في قسم المنتجات المصاحبة المقترحة للاطلاع على أسماء ومصادر المواد المستخدمة في البروتوكول التالي. ملاحظة حول تنشيط الخلايا: يجب تنفيذ الإجراءات التالية في خزانة التهوية باستخدام تقنية التعقيم. 1. عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية الطازجة (PBMC) من 60 مل من الدم الطازج، وغسلها مرتين بمحلول فوسفات ملحي معقم (PBS) بتركيز 1X. ثم طرد الخلايا مركزياً عند 250 × g لمدة 10 دقائق والتخلص من السائل الطافي. 2. تعليق الخلايا في وسط كامل (RPMI [Hyclone، رقم المنتج SH30096] مضاف إليه 1% بنسلين/ستربتومايسين، 1% غلوتامين، و10% مصل بقري جنيني). عدّ الخلايا واضبط تركيزها إلى 2-3 ملايين خلية/مل. 3. تسمية أنبوبين مخروطيين معقمين سعة 50 مل بـ "غير محفز" و"محفز بـ CPG". وزّع مليوني خلية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) في كل أنبوب (مليونا خلية/اختبار). 4. أضف 5 ميكروغرام من قليل النوكليوتيدات CPG لكل مل من الخلايا إلى أنبوب "المحفز بـ CPG". أغلق الأنبوب بإحكام ورجّه برفق. 5. حضّن الأنبوبين لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. 6. خفّف BD FastImmune™ Brefeldin A (BFA) (رقم المنتج 347688) بنسبة 1 إلى 10 في محلول فوسفات ملحي معقم (PBS) بتركيز 1X. 7. أضف 20 ميكرولتر من محلول BFA بتركيز 1X لكل مل إلى كلا الأنبوبين (المحفز وغير المحفز). حضّن الأنبوبين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ملاحظة: احتفظ بكل من CPG وBFA في درجة حرارة -20 درجة مئوية. ٨. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول EDTA بتركيز ٢٠ ملي مولار لكل مل من الخلايا إلى كلا الأنبوبين، ثم حضّنهما طوال الليل عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية. تلوين السطح والخلايا من الداخل: ٩. ضع الأنبوبين في جهاز الطرد المركزي بسرعة ٢٥٠ × g لمدة ١٠ دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم أعد تعليق الخلايا في ٢٥ مل من محلول التلوين BD Pharmigen™ (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦/٥٥٤٦٥٧). ١٠. ضع الأنبوبين في جهاز الطرد المركزي بسرعة ٢٥٠ × g لمدة ١٠ دقائق. تخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق الخلايا في ٢ مل من محلول التلوين. ١١. ضع علامات مناسبة على أنابيب البولي بروبيلين ١٢ × ٧٥ مم. أضف ١٠٠ ميكرولتر من الخلايا إلى كل أنبوب. ١٢. أضف الأجسام المضادة لتلوين السطح إلى كل أنبوب (مزيج FITC المضاد لـ Lin-1 البشري [رقم المنتج 340546]، أو PerCP-Cy™5.5 المضاد لـ CD123 البشري من الفئران [رقم المنتج 558714/560904]، أو PE المضاد لـ HLA-DR البشري من الفئران [رقم المنتج 555561] أو مُقترن PE). حضّن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. ١٣. بعد التحضين، أضف 2 مل من محلول التلوين البارد إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم رجّ الرواسب لإعادة تعليق الخلايا. ١٤. أضف 1 مل من محلول BD Cytofix/Cytoperm™ بدرجة حرارة الغرفة (رقم المنتج 554722) إلى كل أنبوب. امزج جيدًا واحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. 15. أضف 2 مل من محلول BD Perm/Wash™ البارد (رقم المنتج 554723) إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق؛ تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم رجّ الرواسب لإعادة تعليق الخلايا. 16. أضف الجسم المضاد للتلوين داخل الخلايا المضاد للإنترفيرون ألفا البشري (20 ميكرولتر/اختبار) أو عنصر التحكم النظيري المناسب بالحجم المناسب لكل اختبار إلى الأنابيب، وامزج جيدًا بالرجّ. ارفع حجم الاختبار إلى 100 ميكرولتر باستخدام محلول BD Perm/Wash البارد. احضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة في الظلام. 17. أضف 2 مل من محلول BD Perm/Wash البارد إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم قم برجّ الراسب باستخدام جهاز الخلط الدوامي لتعليق الخلايا. ١٨. أضف ٣٠٠ ميكرولتر من محلول BD Perm/Wash البارد إلى كل أنبوب لإجراء تحليل التدفق الخلوي الفوري. اختياري: أعد تعليق الرواسب في ٢٠٠ ميكرولتر من الفورمالديهايد البارد بتركيز ١٪، واحفظ الأنابيب في درجة حرارة ٤ درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى ٢٤ ساعة قبل إجراء تحليل التدفق الخلوي. في حال التخزين لأكثر من ٢٤ ساعة، نوصي بغسل الخلايا في محلول الغسل، حيث أن الحضانة المطولة مع المثبتات قد تؤثر على الفلوركرومات. تحليل التدفق الخلوي وتحليل البيانات: احصل على ٥٠٠٠٠٠ حدث على الأقل (الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة). يلزم اتباع استراتيجية بوابات متسلسلة لتحليل البيانات بنجاح: ١. حدد الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة بدقة باستخدام ملفات تعريف التشتت. ٢. اعرض ملف تعريف Lin-1 مقابل HLA-DR للخلايا اللمفاوية والخلايا الوحيدة المحددة، وحدد المجموعة السالبة لـ Lin-1 والموجبة لـ HLA-DR (R2 في الشكل). تأكد من عدم تضمين أي من الخلايا الموجبة لـ Lin-1. ٣. اعرض ملف تعريف IFN- مقابل CD123 للخلايا المحددة للكشف عن المجموعة الموجبة لـ IFN-. يمكن استخدام عينة غير محفزة كعنصر تحكم سلبي لضبط المؤشرات. افتح البوابة الثانية على Lin-1- HLA-DR+ (R2)، ومن ثم افتح البوابة الثالثة لـ CD123+ IFN-alpha+ (R3). احصل على حوالي ١٥٠-٢٠٠ حدث في الربع الموجب المزدوج CD123+ IFN-alpha+ (R3). انظر أدناه لأمثلة التحديد الصحيح والخاطئ. يُعد التحديد الصحيح لـ IFN-alpha أمرًا بالغ الأهمية للتحليل السليم. فيما يلي مثالان. المثال الأول يوضح الطريقة التي نوصي بها لتحديد نطاق الكشف الصحيح عن إنترفيرون ألفا. أما المثال الثاني فيوضح الطريقة الخاطئة لتحديد نطاق الكشف عن إنترفيرون ألفا.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). يجب استخدام عنصر تحكم متماثل النمط بنفس تركيز الجسم المضاد المطلوب. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد في الماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تُباع مقترنات الأجسام المضادة المصبوغة بصبغات Alexa Fluor® و Pacific Blue™ و Cascade Blue® في هذا المنتج بموجب ترخيص من شركة Molecular Probes, Inc. للاستخدام البحثي فقط، باستثناء استخدامها مع المصفوفات الدقيقة، أو ككواشف خاصة بالمادة المراد تحليلها. تخضع أصباغ Alexa Fluor® (باستثناء Alexa Fluor® 430)، وصبغة Pacific Blue™، وصبغة Cascade Blue® لبراءات اختراع قيد الانتظار وصادرة. يتم جمع انبعاث الفلوركروم Alexa Fluor® 647 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع الألوفيوكوسيانين (APC). للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.