BD، 560097، BD Pharmingen™ PE Mouse anti-Human IFN-α[2b]

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
المستضد: إنترفيرون ألفا 2ب البشري
التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 20 ميكرولتر
RRID: AB_1645511
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتم التخلص من الجسم المضاد غير المرتبط وPE الحر. يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات الفحص الموصى بها: إجراءات الفحص الموصى بها. الإجراء: يرجى الرجوع إلى الجدول في قسم المنتجات المصاحبة المقترحة للاطلاع على أسماء ومصادر المواد المستخدمة في البروتوكول التالي. تنشيط الخلايا: ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراءات التالية في خزانة التهوية باستخدام تقنية التعقيم. 1. عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية الطازجة (PBMC) من 60 مل من الدم الطازج، وغسلها مرتين بمحلول فوسفات ملحي معقم (PBS) بتركيز 1X. ثم طرد الخلايا مركزياً عند 250 × g لمدة 10 دقائق والتخلص من السائل الطافي. 2. تعليق الخلايا في وسط كامل (وسط RPMI مدعم بـ 1% بنسلين/ستربتومايسين، 1% غلوتامين، و10% مصل بقري جنيني). عدّ الخلايا واضبط تركيزها إلى 2-3 ملايين خلية/مل. 3. تسمية أنبوبين مخروطيين معقمين سعة 50 مل بـ "غير محفز" و"محفز بـ CPG". وضع خلايا PBMC في كل أنبوب (2 مليون خلية/مل). ٤. أضف ٥ ميكروغرام من أوليغوديوكسي نيوكليوتيد CPG لكل مل من الخلايا إلى أنبوب "المحفز بـ CPG". أغلق الأنبوب بإحكام وقم برجّه برفق. ٥. حضّن الأنبوبين لمدة ساعتين عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية. ٦. خفف محلول BD FastImmune™ Brefeldin A (BFA) بنسبة ١ إلى ١٠ في محلول فوسفات ملحي معقم بتركيز ١X. ٧. أضف ٢٠ ميكرولتر من محلول BFA بتركيز ١X لكل مل إلى كلا الأنبوبين (المحفز وغير المحفز). حضّن الأنبوبين عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية لمدة ساعتين. ملاحظة: احتفظ بكل من CPG وBFA عند درجة حرارة -٢٠ درجة مئوية. ٨. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول EDTA بتركيز ٢٠ ملي مولار لكل مل من الخلايا إلى كلا الأنبوبين وحضّنهما طوال الليل عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية. التلوين السطحي والخلوي الداخلي ٩. قم بتدوير الأنبوبين في جهاز الطرد المركزي عند ٢٥٠ × g لمدة ١٠ دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم أعد تعليق الخلايا في 25 مل من محلول غسل الخلايا BD FACS. 10. ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق الخلايا في محلول غسل الخلايا FACS بتركيز 20 مليون خلية/مل. 11. ضع علامات مناسبة على أنابيب البولي بروبيلين (12 × 75 مم). أضف 100 ميكرولتر من الخلايا (2 مليون خلية/اختبار) إلى كل أنبوب. 12. أضف الأجسام المضادة لتلوين سطح الخلايا إلى كل أنبوب (Lin-1 البشري FITC، وCD123 البشري PerCPCy5.5، وHLA-DR البشري APC أو PE). حضّن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. 13. بعد التحضين، أضف 2 مل من محلول غسل الخلايا FACS البارد إلى كل أنبوب، ثم ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم رجّ الرواسب لإعادة تعليق الخلايا. ١٤. أضف ١ مل من محلول BD Cytofix/Cytoperm بدرجة حرارة الغرفة إلى كل أنبوب. امزج جيدًا، ثم حضّن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ٣٠ دقيقة. ١٥. أضف ٢ مل من محلول BD Perm/Wash البارد إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند ٥٠٠ × g لمدة ٥ دقائق؛ تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم رجّ الرواسب لإعادة تعليق الخلايا. ١٦. أضف الجسم المضاد للتلوين داخل الخلايا المضاد للإنترفيرون ألفا البشري (٢٠ ميكرولتر/اختبار) أو عنصر التحكم النظيري المناسب بالحجم المناسب لكل اختبار إلى الأنابيب، وامزج جيدًا بالرج. أكمل حجم الاختبار إلى ١٠٠ ميكرولتر باستخدام محلول BD Perm/Wash البارد. حضّن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ٦٠ دقيقة في الظلام. ١٧. أضف ٢ مل من محلول BD Perm/Wash البارد إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند ٥٠٠ × g لمدة ٥ دقائق؛ تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم قم برجّ الراسب باستخدام جهاز الخلط الدوامي لتعليق الخلايا. ١٨. أضف ٣٠٠ ميكرولتر من محلول BD Perm/Wash البارد إلى كل أنبوب لإجراء تحليل التدفق الخلوي الفوري. اختياري: أعد تعليق الرواسب في ٢٠٠ ميكرولتر من الفورمالدهيد البارد بنسبة ١٪، واحفظ الأنابيب عند ٤ درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى ٢٤ ساعة قبل إجراء تحليل التدفق الخلوي. في حال التخزين لأكثر من ٢٤ ساعة، نوصي بغسل الخلايا في محلول الغسل، حيث أن الحضانة المطولة مع المثبتات قد تؤثر على الفلوركرومات. تحليل التدفق الخلوي وتحليل البيانات: احصل على ٥٠٠٠٠٠ حدث على الأقل (خلايا ليمفاوية وخلايا وحيدة النواة). يلزم اتباع استراتيجية بوابات متسلسلة لتحليل البيانات بنجاح: ١. حدد الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة النواة بدقة باستخدام ملفات تعريف التشتت. ٢. اعرض ملف تعريف Lin-1 مقابل HLA-DR للخلايا اللمفاوية والخلايا الوحيدة المحددة، وحدد المجموعة السالبة لـ Lin-1 والموجبة لـ HLA-DR (R2 في الشكل). تأكد من عدم تضمين أي من الخلايا الموجبة لـ Lin-1. ٣. اعرض ملف تعريف IFN- مقابل CD123 للخلايا المحددة للكشف عن المجموعة الموجبة لـ IFN-. يمكن استخدام عينة غير محفزة كعنصر تحكم سلبي لضبط المؤشرات. افتح البوابة الثانية على Lin-1- HLA-DR+ (R2)، ومن ثم افتح البوابة الثالثة لـ CD123+ IFN-alpha+ (R3). احصل على حوالي ١٥٠-٢٠٠ حدث في الربع الموجب المزدوج CD123+ IFN-alpha+ (R3). انظر أدناه لأمثلة التحديد الصحيح والخاطئ. يُعد التحديد الصحيح لـ IFN-alpha أمرًا بالغ الأهمية للتحليل السليم. فيما يلي مثالان. المثال الأول يوضح الطريقة التي نوصي بها لتحديد نطاق الكشف الصحيح عن إنترفيرون ألفا. أما المثال الثاني فيوضح الطريقة الخاطئة لتحديد نطاق الكشف عن إنترفيرون ألفا.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). نظرًا لاختلاف التطبيقات، يجب على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى الرجوع إلى صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد في الماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة.