BD، 560746، محلول نفاذية BD Phosflow™ IV 10×

التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة الغرفة.
إجراءات الفحص الموصى بها: هذا هو البروتوكول القياسي لنفاذية خلايا الدم البيضاء المثبتة باستخدام محلول Perm Buffer IV لتلوين علامات سطح الخلية وبروتينات الإشارة المفسفرة لاحقًا. 1. سخّن محلول التثبيت BD Cytofix™ (رقم المنتج 554655) لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC)، أو محلول التحلل/التثبيت BD Phosflow™ (رقم المنتج 558049) للدم الكامل أو الخلايا الطحالية، إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. 2. خفف محلول Perm Buffer IV إلى تركيز 1.0× باستخدام محلول ملحي فوسفاتي (PBS) بتركيز 1× قبل الاستخدام. 3. حضّر الخلايا. استخدم الخطوة أ لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) أو الخطوة ب للدم الكامل أو الخلايا الطحالية. اعزل الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي (PBMC) باستخدام تقنية الفصل بالتدرج الكثافي (على سبيل المثال، باستخدام أنبوب تحضير الخلايا BD Vacutainer® CPT مع هيبارين الصوديوم، رقم المنتج 362753) من الدم الكامل، واغسل الخلايا جيدًا، ثم عالجها بالمنشط أو المثبط المطلوب أو مزيج منهما. في نهاية معالجة الخلايا، امزج فورًا حجمًا واحدًا من محلول التثبيت BD Cytofix الدافئ مع حجم واحد من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة المعلقة. امزج جيدًا وضع الأنابيب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. قم بترسيب الخلايا بالطرد المركزي عند 400 غرام لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي مكتبي. تخلص من السائل الطافي. أو ب. احصل على دم كامل أو خلايا طحال معلقة. عالج الخلايا (على سبيل المثال، 100 ميكرولتر) بالمنشط و/أو المثبط المطلوب. بعد المعالجة، أضف حجمًا زائدًا بمقدار 20 ضعفًا (مثلاً 2.0 مل) من محلول BD Phosflow™ Lyse/Fix الدافئ. امزج جيدًا، ثم حضّن الأنابيب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. افصل الخلايا بالطرد المركزي عند 400 غرام لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي مكتبي. تخلص من السائل الطافي. 4. اغسل الكريات البيضاء المثبتة مرة واحدة بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). افصل الخلايا بالطرد المركزي عند 400 غرام، وتخلص من كل السائل الطافي. ملاحظة: قد تؤدي الكميات الكبيرة المتبقية من السائل الطافي بعد الطرد المركزي والتخلص من السائل الطافي إلى تخفيف محلول Perm Buffer IV الذي يُضاف لاحقًا، مما قد ينتج عنه نتائج تلوين غير واضحة. 5. رجّ الأنابيب جيدًا لتفكيك الخلايا. اجعل الخلايا نفاذة بإضافة محلول Perm Buffer IV ببطء قطرة قطرة. أضف حوالي 10 مل من محلول Perm Buffer IV لكل 5 إلى 10 ملايين خلية. أضف ما لا يقل عن 1 مل من محلول النفاذية الرابع (Perm Buffer IV) لتركيز الخلايا الأقل من 5 ملايين خلية. حضّن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. ملاحظة 1: قد يؤدي طول مدة النفاذية أو استخدام نسبة حجم الخلايا إلى حجم المحلول خارج النسبة الموصى بها إلى ضعف تلوين وكشف الأجسام المضادة النوعية للعلامات السطحية الفلورية و/أو البروتينات المفسفرة. ملاحظة 2: قد تؤدي النفاذية باستخدام محلول النفاذية الرابع (Perm Buffer IV) إلى انخفاض استعادة الخلايا. 6. افصل الخلايا بالطرد المركزي عند 400 غرام لمدة 10 دقائق، ثم أزل السائل الطافي بالشفط. 7. اغسل الخلايا مرتين بإضافة محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). افصل الخلايا بالطرد المركزي عند 400 غرام لمدة 10 دقائق، ثم أزل السائل الطافي بالشفط في كل مرة. ٨. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) بتركيز ١٠ × ١٠^٦ خلية/مل، ثم قسّم ١٠٠ ميكرولتر إلى كل أنبوب عينة لمتابعة التلوين بالأجسام المضادة وتحليل التدفق الخلوي. تجدر الإشارة أيضًا إلى أنه في حال عدم نجاح تلوين علامات سطح الخلية بعد نفاذية الخلية باستخدام محلول Perm Buffer IV، يمكن تلوين الخلايا مسبقًا بأجسام مضادة فلورية موجهة ضد علامات السطح قبل تثبيت الخلايا أو بين خطوتي التثبيت والنفاذية. بعد ذلك، يمكن إجراء التلوين باستخدام أجسام مضادة خاصة بجزيئات الإشارة الخلوية الداخلية المفسفرة.
إشعارات المنتج: يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يُرجى مراجعة http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS).