BD، 560752، مجموعة BD Pharmingen™ لتحديد النمط الظاهري للخلايا التائية المساعدة البشرية Th1/Th17

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (تم اختباره أثناء التطوير)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869361
الوصف: مكونات الوصف: 51-9006617 كوكتيل تحديد النمط الظاهري للخلايا التائية المساعدة 1/17 البشرية 1.0 مل يحتوي على ما يلي: خلايا CD4 البشرية PerCP-Cy5.5 (النسيلة: SK3) IL-17A البشري PE (النسيلة: N49-653) IFN-GMA البشري FITC (النسيلة: B27) 51-9006613 محلول تثبيت BD Cytofix™ 100 مل 51-2091KE محلول BD Perm/Wash™ 25 مل 51-2092KZ مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (يحتوي على مونينسين) 0.7 مل تشمل مجموعة خلايا CD4+ التائية المحيطية مجموعات فرعية متعددة من الخلايا التائية الفعالة والذاكرة التي تنشأ من خلال التوسع والتمايز المدفوع بالمستضد للخلايا التائية الساذجة. تتميز الاستجابة المبكرة للخلايا التائية المساعدة CD4+ الساذجة للتحفيز المستضدي بتكاثرها السريع ومجموعة محدودة من السيتوكينات. ويؤدي التمايز اللاحق إلى إنتاج خلايا ذات قدرة أكبر على التعبير عن السيتوكينات. وبناءً على توازن السيتوكينات الموضعية، والجزيئات المحفزة المساعدة، ومستويات المستضد، والعوامل الوراثية، تُنتج الاستجابات المناعية خلايا تائية مساعدة من النوع الأول (Th1) وخلايا تائية مساعدة من النوع 17 (Th17) فعالة و/أو ذاكرة. وقد تم تحديد مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة CD4+ ذات استقطاب وظيفي بناءً على أنماط إفراز السيتوكينات المميزة لها. وتنتج خلايا Th1 كميات كبيرة من الإنترفيرون غاما (IFN-γ) بشكل انتقائي، بينما تُعبر خلايا Th17 عن مستويات عالية من الإنترلوكين-17A (IL-17A). ومن خلال إفراز IFN-γ وجزيئات فعالة أخرى، تُنشط خلايا Th1 البلاعم، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK)، والخلايا التائية CD8+، وهي المسؤولة عن المناعة الخلوية. توفر خلايا Th1 الحماية ضد البكتيريا والفطريات والأوليات والفيروسات داخل الخلايا، وتشارك في بعض الاستجابات المناعية الذاتية. أما خلايا Th17، فتقوم عن طريق إفراز الإنترلوكين-17A وعوامل أخرى، بتجنيد وتنشيط العدلات، وتتوسط الاستجابات المناعية ضد البكتيريا والفطريات خارج الخلايا. كما تُشارك خلايا Th17 في الاستجابات المناعية الذاتية. بالإضافة إلى هذه الأنواع من الخلايا التائية المساعدة، وُصفت خلايا شبيهة بـ Th17/Th1 (IL-17A/IFN-γ) التي تُعبر عن كلا السيتوكينين المميزين. يوفر نموذج Th1/Th17 نموذجًا مفيدًا لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط الاستجابات المناعية الوقائية والضارة على حد سواء. توفر مجموعة BD Human Th1/Th17 Phenotyping Kit مزيجًا سهل الاستخدام من ثلاثة ألوان من الأجسام المضادة الفلورية، والمخصصة لبروتين CD4 البشري، والإنترفيرون غاما (للخلايا التائية المساعدة من النوع Th1)، والإنترلوكين-17A (للخلايا التائية المساعدة من النوع Th17). تُمكّن هذه المجموعة الباحثين من تحديد وتوصيف طبيعة هذه الأنواع من الخلايا التائية المساعدة من خلال تحليل التدفق الخلوي متعدد الألوان. يمكن استخدام هذه المجموعة بنجاح لتحليل عينات الخلايا اللمفاوية خارج الجسم الحي (على سبيل المثال، لأنواع الخلايا التائية المساعدة في الدم المحيطي البشري المُنتجة داخل الجسم الحي)، أو لمراقبة تمايز الخلايا التائية المساعدة بواسطة الخلايا المزروعة ضمن أنظمة نماذج تجريبية مختلفة. يُرجى ملاحظة أن لون مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ قد يتراوح من شفاف (عديم اللون) إلى أصفر فاتح.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بـ FITC في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة FITC غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPE الحر. تم ربط الجسم المضاد بـ PerCP-Cy5.5 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPerCP-Cy5.5 الحر. لا يُنصح بتخزين مُقترنات PerCP-Cy5.5 في مُخفف غير مُحسَّن، فقد يؤدي ذلك إلى فقدان شدة الإشارة.
إجراءات التحليل الموصى بها: أ. تحفيز الخلايا: تم الإبلاغ عن طرق مختلفة في المختبر لاستقطاب أو تحفيز مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة، وقد كان استخدام PMA (إستر فوربول) مع أيونوميسين (حامل أيون الكالسيوم) مفيدًا بشكل خاص في التحفيز السريع للخلايا المنتجة للسيتوكينات متعددة النسائل وتوصيفها. نوصي في هذه المجموعة بتحفيز الخلايا الليمفاوية المحيطية أحادية النواة الطبيعية بتركيز يتراوح بين 1 و10 ملايين خلية لكل مل في وسط زراعي لمدة 5 ساعات باستخدام PMA/أيونوميسين (بتركيز 50 نانوغرام/مل و1 ميكروغرام/مل على التوالي) في وجود مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (المرفق مع المجموعة أو رقم المنتج 554724). أضف 4 ميكرولتر من BD GolgiStop™ لكل 6 مل من مزرعة الخلايا واخلط جيدًا. يُنصح بعدم ترك BD GolgiStop™ في مزرعة الخلايا لأكثر من 12 ساعة. ملاحظة: يلزم إجراء دراسات حركية لتحديد وقت الحضانة الأمثل لكل نظام تجريبي. اعتمادًا على المتبرع، قد تختلف ترددات الخلايا المنتجة للسيتوكينات الناتجة عن تنشيط الخلايا الليمفاوية المحيطية أحادية النواة (PBMC) اختلافًا كبيرًا بالنسبة لسيتوكين معين. على وجه الخصوص، قد يكون عدد الخلايا المنتجة للإنترلوكين-17 منخفضًا جدًا أو حتى ضئيلًا في الخلايا الليمفاوية المحيطية أحادية النواة المحفزة بواسطة PMA/Ionomycin. في هذه الحالات، ينبغي النظر في مزارع استقطاب الخلايا التائية المساعدة 17 (Th17). لمزيد من التفاصيل حول استقطاب خلايا Th17، يُرجى الرجوع إلى المراجع. ب. تلوين الخلايا 1. جمع الخلايا: تُجمع الخلايا من مزارع التحفيز المختبرية المعالجة بمثبط نقل البروتين. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتُغسل مرتين بمحلول التلوين (FBS) (رقم المنتج: 554656). تُحصى الخلايا، ويُنقل ما يقرب من مليون خلية إلى كل أنبوب اختبار تدفق (رقم المنتج: 352008) للتلوين المناعي الفلوري. يجب حماية الخلايا من الضوء طوال عملية التلوين والتخزين. ٢. تثبيت الخلايا: أ. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند ٢٥٠ × جم لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تُعلق جيدًا في ١ مل من محلول BD Cytofix™ البارد (المرفق مع المجموعة أو رقم المنتج ٥٥٤٦٥٥) وتُحضن لمدة ١٠-٢٠ دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يمكن تجنب تكتل الخلايا بالتقليب قبل إضافة المُثبت. ب. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند ٢٥٠ × جم لمدة ١٠ دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: بعد التثبيت، تكون الخلايا بعد الطرد المركزي رخوة، لذا يجب توخي الحذر عند شفط محلول الغسل من الأنابيب. لا تشفط كل المحلول، بل اترك ٥٠-١٥٠ ميكرولتر منه في الأنابيب لتجنب فقدان الخلايا في جميع خطوات الغسل اللاحقة. ج. اغسل الخلايا مرتين في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول التلوين (FBS)، ثم قم بفصل الخلايا بالطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في محلول التلوين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة، أو في محلول 90% FCS/10% DMSO عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر (بالنسبة للعينات التي تحتاج إلى تخزينها لأكثر من ستة أشهر، نوصي بإجراء دراسات استقرار). 3. نفاذية الخلايا المثبتة: أ. بالنسبة للخلايا المحفوظة عند 4 درجات مئوية، قم بفصل الخلايا بالطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أزل محلول التلوين. ب. بالنسبة للخلايا المخزنة عند -80 درجة مئوية، قم بإذابتها واغسلها مرتين بمحلول التلوين (FBS) لإزالة DMSO. ج. خفف محلول BD Perm/Wash™ بتركيز 10x (الموجود في المجموعة أو رقم المنتج 554723) في الماء المقطر لتحضير محلول بتركيز 1x قبل الاستخدام. د. علّق الخلايا في 1 مل من محلول BD Perm/Wash™ المخفف (1x) واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. هـ. قم بفصل الخلايا بالطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من السائل الطافي. 4. التلوين باستخدام الكوكتيل: أ. علّق الخلايا المثبتة/المنفذة جيدًا في كل أنبوب في 50 ميكرولتر من محلول BD Perm/Wash™، وأضف 20 ميكرولتر/أنبوب من الكوكتيل أو عينة التحكم السلبية المناسبة. احضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. يجب حماية الخلايا من الضوء طوال عملية التلوين والتخزين. ب. اختياري: تلوين مستضدات سطح الخلية الإضافية. ملاحظة: إذا سمح الجهاز بذلك، يمكن إجراء تلوين متعدد الألوان لمستضدات سطح الخلية المختلفة في هذه المرحلة. مثال: PE-Cy™7 CD3 (النسيلة SK7، رقم المنتج 557851)، وV450 CD8 (النسيلة RPA-T8، رقم المنتج 560347)، وV450 CD45RA (النسيلة HI100، رقم المنتج 560362)، إلخ. لتلوين سطح الخلية بعد التثبيت/النفاذية، يجب تحديد نسيلات الأجسام المضادة المناسبة التي تتعرف على الحواتم المتغيرة. ملاحظة: بالنسبة للأجسام المضادة التي لا تتعرف على علامات سطح الخلية المثبتة/المتغيرة، يُوصى بإجراء التلوين على الخلايا الحية قبل التثبيت/النفاذية. ج. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من محلول BD Perm/Wash™ بتركيز 1× في درجة حرارة الغرفة، ثم علّقها في محلول التلوين (FBS) قبل تحليل التدفق الخلوي. ج. تحليل التدفق الخلوي: اضبط جهد المضاعف الضوئي وتعويضه باستخدام خلايا غير مصبوغة وعلامات سطح الخلية المناسبة، أو استخدم خرزات التعويض BD™ (رقم المنتج 552843) وفقًا للبروتوكول الموصى به. ملاحظة: أُفيد بانخفاض تعبير CD4 على الخلايا التائية بعد تنشيطها. ملاحظة: احصل على ما لا يقل عن 20,000 إلى 30,000 خلية ليمفاوية موجبة لـ CD4. اعتمادًا على المتبرع، قد تختلف ترددات الخلايا المنتجة للسيتوكينات، والناتجة عن تنشيط الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية، اختلافًا كبيرًا بالنسبة لسيتوكين معين. ولإجراء قياسات تردد ذات دلالة إحصائية، ينبغي الحصول على أحجام عينات كبيرة بما يكفي أثناء تحليل التدفق الخلوي. يمكن إنشاء مخططات نقطية ثنائية المتغيرات أو مخططات كفاف احتمالية عند إعادة تحليل البيانات لعرض ترددات وأنماط التعبير المشترك للخلايا الفردية عن مستويات معينة من مستضد سطح الخلية وبروتينات السيتوكينات داخل الخلايا. تحذيرات واحتياطات: خطر: يحتوي مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (المكون 51-2092KZ) على 99.61% إيثانول (وزن/وزن) و0.26% مونينسين، أحادي نترات الصوديوم (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. يسبب تهيجًا خطيرًا للعين. بيانات الاحتياطات: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ قفازات واقية/واقي للعينين. ارتدِ ملابس واقية. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اشطف الجلد بالماء/استحم. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت ويسهل إزالتها. استمر في الشطف. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية. خطر: يحتوي محلول تثبيت BD Cytofix™ (المكون 51-9006613) على 4.2% (وزن/وزن) من الفورمالديهايد. بيانات المخاطر: ضار عند الاستنشاق. يسبب تهيج الجلد. يسبب تلفًا خطيرًا للعين. قد يسبب رد فعل تحسسي للجلد. يُشتبه في تسببه في عيوب وراثية. قد يسبب السرطان. طريقة التعرض: الاستنشاق. قد يسبب تهيجًا في الجهاز التنفسي. بيانات الاحتياطات: ارتدِ ملابس واقية/واقي للعينين. ارتدِ قفازات واقية. لا تستنشق الرذاذ/الأبخرة/البخاخ. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت ويسهل إزالتها. استمر في الشطف. في حالة حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيبًا.
إشعارات المنتج: يرجى مراعاة الاحتياطات التالية: قد يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة في أي مركب فلوري مزدوج؛ لذا، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعريض الكواشف المقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بها، لإضاءة الغرفة. تم تحسين PerCP-Cy5.5 للاستخدام مع ليزر أيون الأرجون الأحادي الذي يصدر ضوءًا بطول موجي 488 نانومتر. نظرًا لطيف الامتصاص الواسع للفلوروفور المزدوج، يجب توخي الحذر عند استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي ثنائية الليزر، والتي قد تُثير كلاً من PerCP وCy5.5™ بشكل مباشر. نوصي باستخدام تعويض الحزمة المتقاطعة أثناء جمع البيانات أو التعويض البرمجي أثناء تحليلها. يمكن استخدام الأجسام المضادة الموسومة بـ PerCP-Cy5.5 مع الكواشف الموسومة بـ FITC وR-PE في أجهزة قياس التدفق الخلوي أحادية الليزر دون تداخل طيفي يُذكر بين تألق PerCP-Cy5.5 وFITC وR-PE. يُباع هذا المنتج المُقترن بـ PerCP بموجب ترخيص من براءة الاختراع الأمريكية رقم 4,876,190. Cy هي علامة تجارية مسجلة لشركة Amersham Biosciences Limited. يُباع هذا المنتج المُقترن بموجب ترخيص من براءات الاختراع الأمريكية أرقام 5,486,616 و5,569,587 و5,569,766 و5,627,027. يخضع هذا المنتج لحقوق الملكية الفكرية لشركة Amersham Biosciences Corp. وجامعة كارنيجي ميلون، ويتم تصنيعه وبيعه بموجب ترخيص من شركة Amersham Biosciences Corp. هذا المنتج مُرخص للبيع لأغراض البحث العلمي فقط. هذا المنتج غير مرخص لأي استخدام آخر. إذا كنت بحاجة إلى ترخيص تجاري لاستخدام هذا المنتج ولم يكن لديك ترخيص، فيُرجى إعادة هذه المادة، غير مفتوحة، إلى شركة BD Biosciences، 10975 Torreyana Rd، سان دييغو، كاليفورنيا 92121، وسيتم رد أي مبلغ مدفوع مقابلها. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources. للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS)، يُرجى زيارة http://regdocs.bd.com.