BD، 560758، مجموعة BD Pharmingen™ لتحديد النمط الظاهري للخلايا التائية المساعدة Th1/Th2/Th17 في الفئران

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (تم اختباره أثناء التطوير)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869363
الوصف: المكونات: 51-9006631 كوكتيل تحديد النمط الظاهري للخلايا التائية المساعدة Th1/Th2/Th17 للفأر 1.0 مل يحتوي على ما يلي: CD4 للفأر PerCP-Cy5.5 (النسيلة: RM4-5) IL-17A للفأر PE (النسيلة: TC11-18H10.1) IFN-GMA للفأر FITC (النسيلة: XMG1.2) IL-4 للفأر APC (النسيلة: 11B11) 51-9006613 محلول تثبيت BD Cytofix™ 100 مل 51-2091KE محلول BD Perm/Wash™ 25 مل 51-2092KZ مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (يحتوي على مونينسين) 0.7 مل تشمل مجموعة الخلايا التائية المساعدة CD4+ المحيطية مجموعات فرعية متعددة من الخلايا التائية الفعالة والذاكرة التي تنشأ من خلال التوسع المدفوع بالمستضد و تمايز الخلايا التائية الساذجة. تتميز الاستجابة المبكرة للخلايا التائية الساذجة CD4+ للتحفيز المستضدي بتكاثر عالٍ ومجموعة محدودة من السيتوكينات. ويؤدي التمايز اللاحق إلى خلايا ذات قدرة أكبر على التعبير عن السيتوكينات. وبناءً على توازن السيتوكينات الموضعية، والجزيئات المحفزة المساعدة، ومستويات المستضد، والعوامل الوراثية، تُنتج الاستجابات المناعية خلايا تائية مساعدة من النوع الأول (Th1)، وخلايا تائية مساعدة من النوع الثاني (Th2)، وخلايا تائية مساعدة من النوع 17 (Th17) فعالة و/أو ذاكرة. وقد تم تحديد مجموعات فرعية من الخلايا التائية CD4+ ذات استقطاب وظيفي بناءً على أنماط إفراز السيتوكينات المميزة لها. وتنتج خلايا Th1 كميات كبيرة من الإنترفيرون غاما (IFN-γ) بشكل انتقائي، بينما تنتج خلايا Th2 إنترلوكين-4 (IL-4) بشكل انتقائي، وتُظهر خلايا Th17 مستويات عالية من إنترلوكين-17A (IL-17A). تقوم خلايا Th1، عبر إفراز الإنترفيرون غاما (IFN-γ) وجزيئات فعالة أخرى، بتنشيط البلاعم والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) وخلايا CD8+ T، وهي المسؤولة عن المناعة الخلوية. توفر خلايا Th1 الحماية ضد البكتيريا والفطريات والأوليات والفيروسات داخل الخلايا، وتشارك في بعض استجابات المناعة الذاتية. يتميز الإنترلوكين-4 (IL-4) الذي تنتجه خلايا Th2 بقدرته الفائقة على تحفيز الخلايا البائية لإنتاج خلايا تفرز الغلوبولين المناعي E (IgE). يلعب IgE دورًا في الاستجابات المناعية التي تتوسطها الخلايا القاعدية/الخلايا البدينة. توفر خلايا Th2 الحماية ضد الطفيليات خارج الخلوية، ولكنها قد تتسبب أيضًا في تطور استجابات تحسسية ضارة. من خلال إفراز الإنترلوكين-17A (IL-17A) وعوامل أخرى، تقوم خلايا Th17 بتجنيد وتنشيط العدلات، وتتوسط الاستجابات المناعية ضد البكتيريا والفطريات خارج الخلوية. كما تشارك خلايا Th17 في استجابات المناعة الذاتية. بالإضافة إلى هذه الأنواع من الخلايا التائية المساعدة، وُصفت خلايا Th0 (التي تُفرز IL-4 و IFN-γ) وخلايا Th17/Th1 الشبيهة (التي تُفرز IL-17A و IFN-γ) التي تُعبّر بشكل مشترك عن سيتوكينات مميزة. يوفر نموذج Th1/Th2/Th17 نظامًا نموذجيًا مفيدًا لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط الاستجابات المناعية الوقائية والضارة على حد سواء. توفر مجموعة BD Mouse Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kit مزيجًا سهل الاستخدام من الأجسام المضادة الفلورية رباعية الألوان - والمخصصة لـ CD4 في الفئران، و IFN-γ (لـ Th1)، و IL-4 (لـ Th2)، و IL-17A (لـ Th17) - مما يُمكّن الباحثين من تحديد وتوصيف طبيعة هذه الأنواع من الخلايا التائية المساعدة من خلال تحليل التدفق الخلوي متعدد الألوان. يمكن استخدام هذه المجموعة لتحليل عينات الخلايا اللمفاوية خارج الجسم الحي بنجاح (مثل تحديد أنواع الخلايا التائية المساعدة المتولدة داخل الجسم الحي) أو لمراقبة تمايز الخلايا التائية المساعدة بواسطة الخلايا المزروعة ضمن أنظمة نماذج تجريبية مختلفة. يُرجى من الباحثين ملاحظة أن لون مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ قد يتراوح بين الشفاف (عديم اللون) والأصفر الفاتح.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بـ FITC في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة FITC غير المتفاعل. تم ربط الجسم المضاد بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPE الحر. تم ربط الجسم المضاد بـ APC في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وAPC الحر. تم ربط الجسم المضاد بـ PerCP-Cy5.5 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPerCP-Cy5.5 الحر. لا يُنصح بتخزين مُقترنات PerCP-Cy5.5 في مُخفف غير مُحسَّن، فقد يؤدي ذلك إلى فقدان شدة الإشارة.
إجراءات التحليل الموصى بها: أ. تحفيز الخلايا: تم الإبلاغ عن طرق مختلفة في المختبر لاستقطاب أو تحفيز مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة، وقد كان استخدام PMA (إستر فوربول) مع أيونوميسين (حامل أيون الكالسيوم) مفيدًا بشكل خاص في التحفيز السريع للخلايا المنتجة للسيتوكينات متعددة النسائل وتوصيفها. نوصي في هذه المجموعة بتحفيز خلايا طحال الفأر بتركيز يتراوح بين 1 و10 ملايين خلية لكل مل في وسط زراعي لمدة 5 ساعات باستخدام PMA/أيونوميسين (بتركيز 50 نانوغرام/مل و1 ميكروغرام/مل على التوالي) في وجود مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (المرفق مع المجموعة أو رقم المنتج 554724). أضف 4 ميكرولتر من BD GolgiStop™ لكل 6 مل من مزرعة الخلايا واخلط جيدًا. يُنصح بعدم ترك BD GolgiStop™ في مزرعة الخلايا لأكثر من 12 ساعة. ملاحظة: يلزم إجراء دراسات حركية لتحديد وقت الحضانة الأمثل لكل نظام تجريبي. اعتمادًا على نوع الفأر، قد تختلف ترددات الخلايا المنتجة للسيتوكينات الناتجة عن تنشيط خلايا الطحال اختلافًا كبيرًا بالنسبة لسيتوكين معين. على وجه الخصوص، قد يكون عدد الخلايا المنتجة للإنترلوكين-17 منخفضًا جدًا أو حتى ضئيلًا عند تحفيز خلايا الطحال باستخدام PMA/Ionomycin. في هذه الحالات، ينبغي النظر في مزارع استقطاب الخلايا التائية المساعدة 17 (Th17). لمزيد من التفاصيل حول استقطاب خلايا Th17، يُرجى الرجوع إلى المراجع. ب. تلوين الخلايا 1. جمع الخلايا: تُجمع الخلايا من مزارع التحفيز المختبرية المعالجة بمثبط نقل البروتين. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتُغسل مرتين بمحلول التلوين (FBS) (رقم المنتج: 554656). عدّ الخلايا وانقل ما يقارب مليون خلية إلى كل أنبوب اختبار تدفق (رقم المنتج: 352008) للتلوين المناعي الفلوري. يجب حماية الخلايا من الضوء طوال عملية التلوين والتخزين. 2. تثبيت الخلايا: أ. قم بتدوير الخلايا عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم علّقها جيدًا في 1 مل من محلول BD Cytofix™ البارد (المرفق مع المجموعة أو رقم المنتج: 554655) واحضنها لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يمكن تجنب تكتل الخلايا عن طريق الخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي قبل إضافة المُثبِّت. ب. قم بتدوير الخلايا عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: بعد التثبيت، تكون كتلة الخلايا بعد الطرد المركزي رخوة، لذا يجب توخي الحذر عند شفط محلول الغسل من الأنابيب. لا تسحب كل المحلول المنظم، بل اترك 50-150 ميكرولتر من المحلول في الأنابيب لتجنب فقدان الخلايا في جميع خطوات الغسل اللاحقة أدناه. ج. اغسل الخلايا مرتين في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول التلوين (FBS)، ثم قم بتدويرها عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في محلول التلوين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة، أو في محلول 90% FCS/10% DMSO عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر (بالنسبة للعينات التي تحتاج إلى تخزينها لأكثر من ستة أشهر، نوصي بإجراء دراسات استقرار). 3. نفاذية الخلايا المثبتة: أ. بالنسبة للخلايا المحفوظة عند 4 درجات مئوية، قم بتدويرها عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أزل محلول التلوين. ب. بالنسبة للخلايا المخزنة عند -80 درجة مئوية، قم بإذابتها واغسلها مرتين باستخدام محلول التلوين (FBS) لإزالة DMSO. ج. قم بتخفيف محلول BD Perm/Wash™ بتركيز 10x (الموجود في المجموعة أو رقم المنتج 554723) في الماء المقطر لتحضير محلول بتركيز 1x قبل الاستخدام. د. علّق الخلايا في 1 مل من محلول BD Perm/Wash™ بتركيز 1x، ثم حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. هـ. قم بفصل الخلايا بالطرد المركزي عند 250 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أزل السائل الطافي. 4. التلوين باستخدام الكوكتيل: أ. علّق الخلايا المثبتة/المنفذة جيدًا في كل أنبوب في 50 ميكرولتر من محلول BD Perm/Wash™، ثم أضف 20 ميكرولتر/أنبوب من الكوكتيل أو عينة التحكم السلبية المناسبة. حضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. يجب حماية الخلايا من الضوء طوال عملية التلوين. ب. اختياري: تلوين مستضدات سطح الخلية الإضافية. ملاحظة: إذا سمح الجهاز بذلك، يمكن إجراء تلوين متعدد الألوان لمستضدات سطح الخلية المختلفة في هذه المرحلة. مثال: APC-Cy™7 CD3 (النسيلة 145-2C11، رقم المنتج 557596) وV450 CD44 (النسيلة IM7، رقم المنتج 560451) إلخ. لتلوين سطح الخلية بعد التثبيت/النفاذية، يجب تحديد نسيلات الأجسام المضادة المناسبة التي تتعرف على الحواتم المتغيرة. ملاحظة: بالنسبة للأجسام المضادة التي لا تتعرف على علامات سطح الخلية المثبتة/المتغيرة، يُوصى بإجراء التلوين على الخلايا الحية قبل التثبيت/النفاذية. ج. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من محلول BD Perm/Wash™ بتركيز 1× في درجة حرارة الغرفة، ثم علّقها في محلول التلوين (FBS) قبل تحليل التدفق الخلوي. ج. تحليل التدفق الخلوي: اضبط جهد PMT والتعويض باستخدام خلايا غير ملونة وعلامات سطح الخلية المناسبة، أو استخدم خرزات التعويض BD™ (رقم المنتج 552844) وفقًا للبروتوكول الموصى به. ملاحظة: ورد أن التعبير عن CD4 على الخلايا التائية ينخفض ​​بعد تنشيطها. ملاحظة: يجب الحصول على ما لا يقل عن 20,000 إلى 30,000 خلية ليمفاوية موجبة لـ CD4. اعتمادًا على المتبرع، قد تختلف ترددات الخلايا المنتجة للسيتوكينات الناتجة عن تنشيط الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية اختلافًا كبيرًا بالنسبة لسيتوكين معين. لإجراء قياسات تردد ذات دلالة إحصائية، يجب الحصول على أحجام عينات كبيرة بما يكفي أثناء تحليل التدفق الخلوي. يمكن إنشاء مخططات نقطية ثنائية المتغيرات أو مخططات كفافية احتمالية عند إعادة تحليل البيانات لعرض ترددات وأنماط التعبير المشترك للخلايا الفردية عن مستويات معينة من مستضد سطح الخلية وبروتينات السيتوكينات داخل الخلايا. تحذيرات واحتياطات: خطر: يحتوي مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (المكون 51-2092KZ) على 99.61% إيثانول (وزن/وزن) و0.26% مونينسين، أحادي صوديوم الأمونيوم (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. يسبب تهيجًا خطيرًا للعين. بيانات الاحتياطات: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ قفازات واقية/واقي للعينين. ارتدِ ملابس واقية. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اشطف الجلد بالماء/استحم. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت ويسهل إزالتها. استمر في الشطف. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية. خطر: يحتوي محلول تثبيت BD Cytofix™ (المكون 51-9006613) على 4.2% (وزن/وزن) من الفورمالديهايد. بيانات المخاطر: ضار عند استنشاقه. يسبب تهيجًا للجلد. يسبب تلفًا خطيرًا للعين. قد يسبب رد فعل تحسسي للجلد. يُشتبه في تسببه في عيوب وراثية. قد يسبب السرطان. طريقة التعرض: الاستنشاق. قد يسبب تهيجًا للجهاز التنفسي. إرشادات السلامة: ارتدِ ملابس واقية/نظارات واقية. ارتدِ قفازات واقية. تجنب استنشاق الرذاذ/الأبخرة. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما جيدًا بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت وكان من السهل إزالتها. استمر في الشطف. في حالة حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيبًا.
إشعارات المنتج: يرجى مراعاة الاحتياطات التالية: قد يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة الذي يحدث في أي مركب فلوري مزدوج؛ لذلك، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعريض الكواشف المقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بهذه الكواشف، لإضاءة الغرفة. Cy هي علامة تجارية لشركة Amersham Biosciences Limited. يُباع هذا المنتج المقترن بموجب ترخيص لبراءات الاختراع التالية: براءات الاختراع الأمريكية رقم 5,486,616؛ 5,569,587؛ 5,569,766؛ 5,627,027. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يُباع هذا المنتج المُقترن بـ PerCP بموجب ترخيص لبراءة الاختراع الأمريكية رقم 4,876,190. يمكن استخدام هذا الكاشف المُقترن بـ APC في أي جهاز قياس تدفق خلوي مزود بليزر صبغة أو ليزر هيليوم-نيون أو ليزر ثنائي أحمر. يمكن استخدام الأجسام المضادة الموسومة بـ PerCP-Cy5.5 مع الكواشف الموسومة بـ FITC وR-PE في أجهزة قياس التدفق الخلوي أحادية الليزر دون تداخل طيفي كبير بين تألق PerCP-Cy5.5 وFITC وR-PE. تم تحسين PerCP-Cy5.5 للاستخدام مع ليزر أيون الأرجون الأحادي الذي يُصدر ضوءًا بطول موجي 488 نانومتر. نظرًا لطيف الامتصاص الواسع للفلوركروم المزدوج، يجب توخي الحذر الشديد عند استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي ثنائية الليزر، والتي قد تُثير كلاً من PerCP وCy5.5™ بشكل مباشر. نوصي باستخدام تعويض الحزمة المتقاطعة أثناء جمع البيانات أو التعويض البرمجي أثناء تحليلها. يخضع هذا المنتج لحقوق الملكية الفكرية لشركة Amersham Biosciences Corp. وجامعة كارنيجي ميلون، ويتم تصنيعه وبيعه بموجب ترخيص من شركة Amersham Biosciences Corp. هذا المنتج مرخص للبيع لأغراض البحث العلمي فقط، ولا يُرخص لأي استخدام آخر. إذا كنت بحاجة إلى ترخيص تجاري لاستخدام هذا المنتج ولم يكن لديك ترخيص، فيُرجى إعادة هذه المادة غير مفتوحة إلى BD Biosciences، 10975 Torreyana Rd، سان دييغو، كاليفورنيا 92121، وسيتم رد أي مبلغ مدفوع مقابلها. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.