BD، 560767، مجموعة BD Pharmingen™ لتحديد النمط الظاهري للفئران Th17/Treg

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (تم اختباره أثناء التطوير)
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
RRID: AB_2869367
الوصف: المكونات: 51-9006647 مزيج تحديد النمط الظاهري للخلايا التائية المساعدة 17/الخلايا التائية التنظيمية للفأر 1.0 مل يحتوي على ما يلي: CD4 للفأر PerCP-Cy5.5 (النسيلة: RM4-5) IL-17A للفأر PE (النسيلة: TC11-18H10.1) Foxp3 للفأر Alexa Fluor® 647 (النسيلة: MF23) 51-9006124 مركز تثبيت Foxp3 للفأر (20x) 10 مل 51-9006125 مركز نفاذية Foxp3 للفأر (5x) 80 مل 51-2092KZ مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (يحتوي على مونينسين) 0.7 مل يحمي الجهاز المناعي الأفراد من مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض مع تجنب الاستجابات المناعية غير المناسبة أو المفرطة، مثل استجابات المناعة الذاتية التي قد تكون ضار. تشمل مجموعة خلايا CD4+ T المحيطية عدة مجموعات فرعية متميزة وظيفيًا من خلايا T، تنشأ من خلال التمايز التيمي أو نتيجة لتوسع وتمايز خلايا T الساذجة المحيطية بفعل المستضد. قد تتميز الاستجابة المبكرة لخلايا CD4+ T الساذجة للتحفيز المستضدي بتكاثر عالٍ ومجموعة محدودة من السيتوكينات. ويؤدي المزيد من التمايز إلى خلايا ذات قدرة أكثر تنوعًا على التعبير عن السيتوكينات. وبناءً على توازن السيتوكينات المحلية، والجزيئات المحفزة المساعدة، ومستويات المستضد، والعوامل الوراثية، يمكن توليد خلايا Th17 الفعالة/الذاكرة أو خلايا CD4+ T التنظيمية المستحثة (iTregs) من مجموعة خلايا CD4+ T الساذجة. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي مجموعة خلايا T المحيطية على خلايا CD4+ T التنظيمية الطبيعية (nTregs) التي تتولد في التيموس كمجموعة فرعية ناضجة وظيفيًا من خلايا T. تم تحديد مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة CD4+ ذات استقطاب وظيفي بناءً على أنماطها المميزة في إفراز السيتوكينات، والتعبير عن عوامل النسخ، ووظائفها. تُعبر الخلايا التائية المساعدة 17 (Th17) عن مستويات عالية من إنترلوكين-17A (IL-17A) كسيتوكين مميز، بينما تتميز الخلايا التائية التنظيمية (Treg) بالتعبير عن عامل النسخ FoxP3. من خلال إفراز IL-17A وعوامل أخرى، تستقطب خلايا Th17 العدلات وتنشطها، وتتوسط الاستجابات المناعية ضد البكتيريا والفطريات خارج الخلوية. كما تُشارك خلايا Th17 في التوسط في الاستجابات المناعية الذاتية. تستطيع الخلايا التائية التنظيمية الطبيعية والمستحثة تثبيط وظيفة الخلايا التائية الأخرى أو أنواع الخلايا الأخرى المشاركة في الاستجابة المناعية من خلال آليات متنوعة، بما في ذلك السيتوكينات. وبهذه الطريقة، تحمي الخلايا التائية التنظيمية من استجابة الجهاز المناعي للمستضدات الذاتية، وتكبح الاستجابة المفرطة للمستضدات الغريبة التي قد تكون ضارة بالمضيف. يُوفر نموذج Th17/Treg نظامًا نموذجيًا مفيدًا لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط الاستجابات المناعية الوقائية والضارة، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية. تُقدم مجموعة BD Mouse Th17/Treg Phenotyping Kit مزيجًا سهل الاستخدام من ثلاثة ألوان من الأجسام المضادة الفلورية، المُخصصة لـ CD4 في الفئران، وIL-17A (لـ Th17)، وFoxp3 (لـ Treg)، مما يُمكّن الباحثين من تحديد وتوصيف طبيعة أنواع خلايا CD4+ T الموجودة في نظامهم من خلال تحليل التدفق الخلوي متعدد الألوان. يُمكن استخدام هذه المجموعة لتحليل عينات الخلايا اللمفاوية خارج الجسم الحي بنجاح (على سبيل المثال، لأنواع مجموعات خلايا CD4+ T المُولدة داخل الجسم الحي في الفئران) أو لمراقبة تمايز خلايا CD4+ T المُستزرعة ضمن أنظمة نموذجية تجريبية مُختلفة. يُرجى ملاحظة أن لون مُثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ قد يتراوح من شفاف (عديم اللون) إلى أصفر فاتح.
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بـ R-PE في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPE الحر. تم ربط الجسم المضاد بـ PerCP-Cy5.5 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وPerCP-Cy5.5 الحر. لا يُنصح بتخزين مُقترنات PerCP-Cy5.5 في مُخفف غير مُحسَّن، فقد يؤدي ذلك إلى فقدان شدة الإشارة. تم ربط الجسم المضاد بـ Alexa Fluor® 647 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة Alexa Fluor® 647 غير المتفاعل.
إجراءات الفحص الموصى بها: أ. تحفيز الخلايا: تم الإبلاغ عن طرق مختلفة لاستقطاب وتحفيز مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة لإنتاج إنترلوكين-17 في المختبر. وقد كان التنشيط قصير الأمد باستخدام أسيتات فوربول ميريستات (PMA؛ منشط بروتين كيناز C) بالإضافة إلى أيونوميسين (حامل أيونات الكالسيوم) مفيدًا لتحفيز وتوصيف الخلايا متعددة النسائل المنتجة للسيتوكينات بسرعة. ومع ذلك، فإن التحفيز خارج الجسم الحي للخلايا اللمفاوية المستأصلة حديثًا من الفئران باستخدام PMA وأيونوميسين في المزرعة لعدة ساعات يؤدي عادةً إلى الكشف عن نسبة صغيرة فقط من الخلايا المنتجة لإنترلوكين-17A. بالنسبة لهذه المجموعة، نوصي باستقطاب الخلايا التائية CD4+ المُثرية لمدة 5 أيام والمزروعة في وجود TGFβ، يليه إعادة تحفيز لمدة 4 ساعات باستخدام PMA + أيونوميسين في وجود مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™. ملاحظة: يلزم إجراء دراسات حركية لتحديد وقت الحضانة الأمثل لكل نظام تجريبي. إجراء توليد خلايا منتجة لـ IL-17A في الفئران: 1. تحضير معلق خلوي أحادي من الخلايا الطحالية لفأر من سلالة BALB/c. 2. تحليل خلايا الدم الحمراء (باستخدام محلول تحلل BD PharmLyse™ بتركيز 1×، رقم المنتج 555899). 3. عزل خلايا CD4+ T باستخدام طريقة اختيار الخلايا السلبية أو الإيجابية. ٤. تُزرع الخلايا لمدة أربعة أيام في وسط زراعة الأنسجة RPMI-1640 الكامل، مع إضافة الأجسام المضادة لـ CD3 المرتبطة بالصفيحة (رقم المنتج 553057؛ 10 ميكروغرام/مل؛ تُغطى آبار صفيحة زراعة الأنسجة طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية؛ تُغسل الآبار ثلاث مرات بمحلول دولبيكو الفوسفاتي الملحي)، والأجسام المضادة الذائبة لـ CD28 (رقم المنتج 553294؛ تركيز نهائي 2 ميكروغرام/مل)، وبروتينات IL-1β الفأرية المؤتلفة (رقم المنتج 554577؛ 50 نانوغرام/مل)، وIL-6 الفأرية (رقم المنتج 554582؛ 25 نانوغرام/مل)، وTGFβ (رقم المنتج 356039؛ 5 نانوغرام/مل). يُضاف وسط زراعة جديد في اليوم الثالث أو الرابع إذا لزم الأمر. ٥. في اليوم الخامس، تُحصد الخلايا وتُغسل مرة واحدة بوسط زراعة الأنسجة RPMI-1640 الكامل. ٦. يُعاد تحفيز الخلايا باستخدام ٥٠ نانوغرام/مل من PMA (سيجما، رقم المنتج P-8139) و١ ميكروغرام/مل من الأيونوميسين (سيجما، رقم المنتج I-0634) بوجود مونينسين (مثبط نقل البروتين BD Golgistop™، رقم المنتج ٥٥٤٧٢٤) في وسط RPMI-1640 الكامل. تُحضن الخلايا لمدة أربع إلى خمس ساعات. ٧. تُحصد الخلايا. ٨. تُغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS)* (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦). ٩. تُثبت الخلايا وفقًا لإجراء تلوين Foxp3 الموضح أدناه. اختياري (يمكن تجميد الخلايا وتخزينها لاستخدامها لاحقًا بعد التثبيت) 1. ثبّت الخلايا باستخدام محلول تثبيت Foxp3 للفئران من BD Pharmingen™ (مرفق، رقم المنتج 560409) بتركيز 10 ملايين خلية/مل لمدة 30 دقيقة على الجليد. 2. اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول التلوين (FBS) من BD Pharmingen™* (5 مل من محلول الغسل لكل 10 ملايين خلية). 3. عدّ الخلايا وعلقها بتركيز 10 ملايين خلية/مل في محلول 10% DMSO/90% FCS. 4. جمّد الخلايا عند درجة حرارة -80 درجة مئوية في أنبوب تجميد. ب. تلوين الخلايا: اجمع الخلايا من مزارع الخلايا المحفزة عن طريق الطرد المركزي (300x g) وعلقها في محلول التلوين (FBS) من BD Pharmingen™*. عدّ الخلايا واضبط تركيزها إلى 10 ملايين خلية/مل في محلول التلوين (FBS) من BD Pharmingen™*. بالنسبة للخلايا المجمدة، أزل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بغسل الخلايا المذابة بـ 5 مل من محلول التلوين BD Pharmingen Stain Buffer (FBS)* لكل قارورة مجمدة، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 300x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. علّق الراسب بتركيز 10 ملايين خلية/مل في محلول التلوين BD Pharmingen Stain Buffer (FBS)*، ووزّع مليون خلية في كل بئر من صفيحة 96 بئراً. قم بالطرد المركزي، ثم أزل المحلول، وتابع الإجراء من الخطوة 7. ملاحظة حول إجراء التلوين: هذا الإجراء مخصص لتلوين الخلايا في صفائح 96 بئراً ذات قاع على شكل حرف U. إذا كنت تفضل تلوين الخلايا في أنابيب، فعدّل حجم الغسل إلى 1 مل. 1. أزل تكتلات الخلايا و/أو الحطام بتمرير معلق الخلايا عبر مصفاة خلايا BD Falcon™ المصنوعة من النايلون بمسام 70 ميكرومتر (رقم المنتج 352235). 2. خفف الخلايا إلى تركيز 10 ملايين خلية/مل. 3. قسّم مليون خلية إلى حصص متساوية لكل بئر، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 300 ضعف قوة الجاذبية الأرضية لمدة 5 دقائق، ثم أزل المحلول المنظم. 4. لتثبيت الخلايا، علّق راسب الخلايا برفق في الحجم المتبقي من محلول التلوين، ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول تثبيت Foxp3 للفئران من BD Pharmingen™ البارد والمُحضّر حديثًا (مرفق، رقم المنتج 560409). اخلط جيدًا. حضّن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. 5. قم بالطرد المركزي بسرعة 300 ضعف قوة الجاذبية الأرضية لمدة 5 دقائق، ثم أزل المُثبّت. 6. لغسل الخلايا، علّق كل راسب في 200 ميكرولتر من محلول نفاذية Foxp3 للفئران من BD Pharmingen™ المُحضّر حديثًا والمُسخّن مسبقًا (37 درجة مئوية) (مرفق، رقم المنتج 560409)، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 300 ضعف قوة الجاذبية الأرضية لمدة 5 دقائق. أزل محلول النفاذية. ٧. لزيادة نفاذية الخلايا، علّق راسب الخلايا برفق في ٢٠٠ ميكرولتر إضافية من محلول BD Pharmingen™ Mouse Foxp3 Permeabilization Buffer المُحضر حديثًا والمُسخن مسبقًا (٣٧ درجة مئوية) بتركيز ١×. حضّن لمدة ٣٠ دقيقة عند ٣٧ درجة مئوية في الظلام. ٨. افصل الخلايا بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × g لمدة ٥ دقائق، ثم أزل المحلول. ٩. لغسل الخلايا، أضف ٢٠٠ ميكرولتر من محلول BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) إلى كل أنبوب، ثم افصل بالطرد المركزي عند ٣٠٠ × g لمدة ٥ دقائق. أزل المحلول. كرر العملية. ١٠. أضف ٢٠ ميكرولتر/اختبار من مزيج تحديد النمط الظاهري للخلايا التائية المساعدة ١٧/الخلايا التائية التنظيمية للفئران أو عينة التحكم السلبية المناسبة. حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة في الظلام. يجب حماية الخلايا من الضوء طوال فترة التلوين والتخزين. ١١. كرر خطوة الغسل رقم ٩ أعلاه مرتين. ١٢. علّق راسب الخلايا في ٢٠٠ ميكرولتر من محلول التلوين، ثم تابع تحليل التدفق الخلوي. ج. تحليل التدفق الخلوي: اضبط جهد المضاعف الضوئي وتعويضه باستخدام خلايا غير ملونة وعلامات سطح الخلية المناسبة. ملاحظة: أُفيد بانخفاض تعبير CD4 على الخلايا التائية بعد تنشيطها. * يُوصى باستخدام محلول التلوين BD Pharmingen (FBS) (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦) للتلوين السطحي الأولي وجميع خطوات الغسل، وتغطية الأنابيب أثناء خطوات الحضانة بأغطية أو غشاء بارافين. تحذيرات واحتياطات: خطر: يحتوي مثبط نقل البروتين BD GolgiStop™ (المكون ٥١-٢٠٩٢KZ) على ٩٩.٦١٪ إيثانول (وزن/وزن) و٠.٢٦٪ مونينسين، أحادي نترات الصوديوم (وزن/وزن). بيانات المخاطر: سائل وبخار شديد الاشتعال. يُسبب تهيجًا خطيرًا للعين. بيانات تحذيرية: يُحفظ بعيدًا عن الحرارة/الشرر/اللهب المكشوف/الأسطح الساخنة. ممنوع التدخين. ارتدِ قفازات واقية/نظارات واقية. ارتدِ ملابس واقية. في حالة ملامسة الجلد (أو الشعر): انزع/اخلع جميع الملابس الملوثة فورًا. اشطف الجلد بالماء/استحم. في حالة ملامسة العينين: اشطفهما بحذر بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة، إن وجدت ويسهل إزالتها. استمر في الشطف. تخلص من المحتويات/العبوة وفقًا للوائح المحلية/الإقليمية/الوطنية/الدولية. خطر: يحتوي مُركّز تثبيت Foxp3 للفئران (20x) (المكون 51-9006124) على 4.2% فورمالديهايد (وزن/وزن). بيانات المخاطر: ضار عند الاستنشاق. يُسبب تهيج الجلد. يُسبب تلفًا خطيرًا للعين. قد يُسبب رد فعل تحسسي للجلد. يُشتبه في أنه يُسبب عيوبًا وراثية. قد يُسبب السرطان. طريقة التعرض: الاستنشاق. قد يُسبب تهيجًا في الجهاز التنفسي. بيانات تحذيرية: ارتدِ ملابس واقية/نظارات واقية. ارتدِ قفازات واقية. تجنب استنشاق الرذاذ/الأبخرة/البخاخ. في حال ملامسة العينين: اشطفهما جيدًا بالماء لعدة دقائق. أزل العدسات اللاصقة إن وجدت وكان من السهل إزالتها. استمر في الشطف. في حال حدوث تهيج أو طفح جلدي: استشر طبيبًا.
إشعارات المنتج: يُرجى مراعاة الاحتياطات التالية: قد يؤدي امتصاص الضوء المرئي إلى تغيير كبير في نقل الطاقة في أي مُقترن فلوري مزدوج؛ لذا، نوصي باتخاذ احتياطات خاصة (مثل تغليف القوارير أو الأنابيب أو الحوامل بورق الألومنيوم) لمنع تعريض الكواشف المُقترنة، بما في ذلك الخلايا المصبوغة بهذه الكواشف، لإضاءة الغرفة. يتم جمع انبعاث فلوروكروم Alexa Fluor® 647 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع الألوفيوكوسيانين (APC). يمكن استخدام الأجسام المضادة الموسومة بـ PerCP-Cy5.5 مع الكواشف الموسومة بـ FITC وR-PE في أجهزة قياس التدفق الخلوي أحادية الليزر دون تداخل طيفي كبير بين فلورة PerCP-Cy5.5 وFITC وR-PE. تم تحسين PerCP-Cy5.5 للاستخدام مع ليزر أيون الأرجون الأحادي الذي يُصدر ضوءًا بطول موجي 488 نانومتر. نظراً لطيف الامتصاص الواسع للفلوروكروم المزدوج، يجب توخي الحذر الشديد عند استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي ثنائية الليزر، حيث قد تُثير مباشرةً كلاً من PerCP وCy5.5™. نوصي باستخدام تعويض الحزمة المتقاطعة أثناء جمع البيانات أو التعويض البرمجي أثناء تحليلها. Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. تُباع مُقترنات الأجسام المضادة المصبوغة بصبغات Alexa Fluor® وPacific Blue™ وCascade Blue® في هذا المنتج بموجب ترخيص من شركة Molecular Probes, Inc. للاستخدام البحثي فقط، باستثناء استخدامها مع المصفوفات الدقيقة أو ككواشف خاصة بالمادة المُحللة. صبغات Alexa Fluor® (باستثناء Alexa Fluor® 430) وصبغة Pacific Blue™ وصبغة Cascade Blue® محمية ببراءات اختراع قيد الانتظار وصادرة. Cy علامة تجارية لشركة Amersham Biosciences Limited. يُباع هذا المنتج المُقترن بموجب ترخيص من براءات الاختراع الأمريكية التالية: 5,486,616؛ 5,569,587؛ 5,569,766؛ 5,627,027. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، تقع في الولايات المتحدة. تنبيه: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. لذا، يُرجى تخفيف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يخضع هذا المنتج لحقوق الملكية الفكرية لشركة Amersham Biosciences Corp. وجامعة كارنيجي ميلون، ويتم تصنيعه وبيعه بموجب ترخيص من شركة Amersham Biosciences Corp. هذا المنتج مُرخص للبيع لأغراض البحث العلمي فقط، ولا يُرخص لأي استخدام آخر. إذا كنتَ بحاجة إلى ترخيص تجاري لاستخدام هذا المنتج ولم يكن لديك ترخيص، فيُرجى إعادة هذه المادة، غير مفتوحة، إلى شركة BD Biosciences، 10975 Torreyana Rd، سان دييغو، كاليفورنيا 92121، وسيتم ردّ أي مبلغ مدفوع مقابلها. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.