BD، 560930، BD Pharmingen™ PE Annexin V

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_2869071
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيداً عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ PE Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة (Kd ~5 × 10⁻²) بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط PE Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين PE Annexin V. ينبغي على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام PE Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز الاستماتة باستخدام جسم مضاد بشري لـ CD95 (FAS): يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام PE Annexin V على خط خلوي بشري. المواد: 1. خط خلوي أو خلايا أولية يمكن تحفيزها بسهولة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري لـ Fas. تشمل الأمثلة خلايا ليمفوما داودي (ATCC CCL-213) وخلايا جركات تي (ATCC TIB-152). من المهم ملاحظة أنه قد يكون هناك تباين كبير بين الخطوط الخلوية فيما يتعلق بمستوى الاستماتة التي يمكن تحفيزها من خلال مستقبل Fas. أيضًا، ليس بالضرورة أن تخضع جميع أنواع الخلايا التي تُعبِّر عن مستضد Fas للاستماتة بوساطة Fas. تُعد الخطوط الخلوية المذكورة أعلاه ضوابط إيجابية جيدة لأنها تُحفَّز بقوة على الخضوع للاستماتة بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة لـ Fas. 2. الجسم المضاد أحادي النسيلة البشري لـ CD95 (Fas)، المستنسخ DX2 (رقم المنتج 555670). 3. بروتين G المؤتلف (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج P4689). وجدنا أن إضافة بروتين G إلى وسط زراعة الأنسجة يُحسّن بشكل ملحوظ كفاءة مستنسخ DX2 في تحفيز الاستماتة الخلوية. 4. قوارير زراعة الأنسجة T25. 5. وسط IMDM أو RPMI 1640 مع 10% من مصل الأبقار الجنيني المُعطّل حراريًا (FBS)، و1% من الجلوتامين، و1% من المضادات الحيوية (بنسلين/ستربتومايسين؛ 100 وحدة/مل). يُشار إلى هذا الوسط المُدعّم ببساطة باسم "الوسط" فيما يلي. الإجراء: 1. حافظ على الخلايا في المزرعة، وغيّر الوسط قبل يوم واحد من تحفيز الاستماتة الخلوية. ٢. تحفيز الاستماتة: أضف ٠٫٥ - ٢ ميكروغرام/مل من الجسم المضاد لـ CD95 (مستنسخ DX2) و١-٢ ميكروغرام/مل من البروتين G إلى قارورة T25 تحتوي على وسط غذائي يحتوي على حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل. يجب أن تتكون الضوابط السلبية مما يلي: (أ) حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل مع الوسط الغذائي فقط (بدون جسم مضاد أحادي النسيلة أو بروتين G)، و(ب) حوالي ٠٫٥ × ١٠⁶ خلية/مل مع الوسط الغذائي و١ ميكروغرام/مل من البروتين G فقط (بدون جسم مضاد أحادي النسيلة). ٣. حضّن الخلايا لمدة ٢ إلى ١٢ ساعة عند ٣٧ درجة مئوية. ٤. تابع بروتوكول تلوين PE Annexin V لقياس الاستماتة. يمكن أيضًا ملاحظة موت الخلايا المبرمج (الاستماتة) باستخدام المجهر الضوئي، أو الرحلان الكهربائي الهلامي (سلالم تجزئة الحمض النووي)، أو باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي القائم على تجزئة الحمض النووي، مثل مجموعة APO-BRDU™ (رقم المنتج 556405) أو مجموعة APO-DIRECT™ (رقم المنتج 556381). تحفيز الاستماتة باستخدام جسم مضاد للفأر CD95 (FAS): يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام PE Annexin V على خلايا الفئران. المواد: 1. خط خلوي أو خلايا أولية يمكن تحفيزها بسهولة على الخضوع للاستماتة بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر Fas. يمكن استخدام الخلايا التيموسية المعزولة من فأر BALB/c بعمر 4-6 أسابيع. ٢. جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD95 (Fas) في الفئران، مستنسخ Jo2 (رقم المنتج 554254). ٣. بروتين G مُعاد التركيب (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج P4689). وجدنا أن إضافة بروتين G إلى وسط زراعة الأنسجة يُحسّن بشكل ملحوظ فعالية الجسم المضاد Jo2 في تحفيز الاستماتة الخلوية. ٤. قوارير زراعة الأنسجة T25. ٥. وسط RPMI-1640 مع ١٠٪ من مصل جنين البقر المُعطّل حراريًا (FBS)، و١٪ من الجلوتامين، و١٪ من المضادات الحيوية (بنسلين/ستربتومايسين؛ ١٠٠ وحدة/مل). يُشار إلى هذا الوسط المُدعّم ببساطة باسم "الوسط" فيما يلي. الإجراء: ١. عزل الخلايا التائية من غدة التيموس لفأر من سلالة BALB/c، عمره من ٤ إلى ٦ أسابيع. ٢. تحفيز الاستماتة الخلوية. أضف 2.5-10 ميكروغرام/مل من Jo2 (رقم المنتج 554254) إلى قارورة T25 تحتوي على ما يقارب 2 × 10⁶ إلى 1 × 10⁷ خلية تائية/مل. يجب أن تتكون الضوابط السلبية من: (أ) ما يقارب 2 × 10⁶ إلى 1 × 10⁷ خلية تائية/مل مع وسط زراعي فقط (بدون أجسام مضادة أحادية النسيلة)، و(ب) وسط زراعي يحتوي على ضابط نمط متماثل من الهامستر (النسيلة Ha4/8، رقم المنتج 553961). استخدم تراكيز من الأجسام المضادة مماثلة لتلك المستخدمة مع Jo2 في ضابط النمط المتماثل. 3. حضّن الخلايا لمدة 2-12 ساعة عند 37 درجة مئوية. 4. تابع بروتوكول تلوين PE Annexin V لقياس الاستماتة الخلوية. يمكن أيضًا ملاحظة موت الخلايا المبرمج (الاستماتة) باستخدام المجهر الضوئي، أو الرحلان الكهربائي الهلامي (سلالم تجزئة الحمض النووي)، أو باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي القائم على تجزئة الحمض النووي، مثل مجموعة APO-BRDU™ (رقم المنتج 556405) أو مجموعة APO-DIRECT™ (رقم المنتج 556381). يُستخدم بروتوكول تلوين الأنيكسين V المُبَيَّن بالبولي إيثيلين جليكول لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تخضع للاستماتة بشكل كمي ضمن مجموعة من الخلايا. يعتمد هذا البروتوكول على خاصية فقدان الخلايا لتناظر غشائها في المراحل المبكرة من الاستماتة. في الخلايا المستميتة، ينتقل الفوسفوليبيد الغشائي فوسفاتيديل سيرين (PS) من الطبقة الداخلية للغشاء البلازمي إلى الطبقة الخارجية، مما يعرضه للبيئة الخارجية. أنيكسين V هو بروتين رابط للفوسفوليبيدات يعتمد على الكالسيوم، وله ألفة عالية للفوسفاتيديل سيرين (PS)، ويُستخدم لتحديد الخلايا الميتة التي تظهر فيها جزيئات PS مكشوفة. أما 7-أمينو-أكتينوميسين (7-AAD) فهو مسبار قياسي لقياس حيوية الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي، ويُستخدم للتمييز بين الخلايا الحية وغير الحية. الخلايا الحية ذات الأغشية السليمة لا تسمح بمرور 7-AAD، بينما أغشية الخلايا الميتة والتالفة تسمح بمروره. الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لأنيكسين V المُرتبط بالبولي إيثيلين جليكول (PE) وتلوينًا سلبيًا لـ 7-AAD تكون في طور الموت الخلوي المبرمج (الاستماتة). أما الخلايا التي تُظهر تلوينًا إيجابيًا لكل من أنيكسين V المُرتبط بالبولي إيثيلين جليكول و7-AAD فتكون إما في المرحلة النهائية من الاستماتة، أو في طور النخر، أو ميتة بالفعل. بينما الخلايا التي تُظهر تلوينًا سلبيًا لكل من أنيكسين V المُرتبط بالبولي إيثيلين جليكول و7-AAD فهي حية ولا تخضع لعملية استماتة قابلة للقياس. الكواشف: 1. أنيكسين V المُرتبط بالبولي إيثيلين جليكول: مُضمن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. ٢. ٧-أمينو-أكتينوميسين د (٧-AAD): غير مُضمّن. ٧-AAD (رقم المنتج ٥٥٩٩٢٥) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم ٥ ميكرولتر لكل اختبار. ٣. محلول الربط ١٠×: غير مُضمّن. ٠.١ مولار هيبس (الأس الهيدروجيني ٧.٤)، ١.٤ مولار كلوريد الصوديوم، ٢٥ ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة ٤ درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء المنتج برقم المنتج ٥٥٦٤٥٤. التلوين: ١. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط ١× بتركيز ١ × ١٠⁶ خلية/مل. ٢. انقل ١٠٠ ميكرولتر من المحلول (١ × ١٠⁵ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة ٥ مل. 3. أضف 5 ميكرولتر من PE Annexin V (لتحليل اللون الواحد واللونين) و5 ميكرولتر من 7-AAD (لتحليل اللونين فقط). 4. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في الظلام. 5. أضف 400 ميكرولتر من محلول الربط 1× إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: 1. خلايا غير مصبوغة. 2. خلايا مصبوغة بـ PE Annexin V فقط (بدون 7-AAD). 3. خلايا مصبوغة بـ 7-AAD فقط (بدون PE Annexin V). ضوابط التلوين الأخرى: ينبغي استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام PE Annexin V و/أو PE Annexin V و7-AAD. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (PE Annexin V إيجابي، 7-AAD سلبي أو PE Annexin V إيجابي، 7-AAD إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا المستميتة والميتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي تم تحفيزها على الخضوع للاستماتة عن طريق طرح نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة غير المعالجة من نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة المعالجة. بما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للخلايا التي تخضع للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة سيكون لها غشاء تالف وستصبغ بشكل إيجابي لـ 7-AAD وكذلك لـ PE Annexin V. وبالتالي، فإن الفحص لا يميز بين الخلايا التي خضعت بالفعل لموت الخلايا المبرمج وتلك التي ماتت نتيجة لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستصبغ الخلايا الميتة بكل من PE Annexin V و 7-AAD.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى مراجعة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة.