BD، 561382، BD Horizon™ V450 مضاد الفأر IFN-α البشري[2b]

الاسم البديل: IFNa، IFNα
التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المصلي: IgG1 الفأري، κ
المستضد: إنترفيرون ألفا 2ب البشري
التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_10716058
محلول التخزين: محلول منظم مائي يحتوي على مثبت بروتين و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بـ BD Horizon™ V450 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة BD Horizon™ V450 غير المتفاعل. يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد.
إجراءات الفحص الموصى بها: إجراءات الفحص الموصى بها - إجراء تنشيط الخلايا - ملاحظة: يجب إجراء عملية تنشيط الخلايا التالية في خزانة زراعة الأنسجة باستخدام تقنية التعقيم. 1. عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية الطازجة (PBMC) من 60 مل من الدم الطازج، وغسلها مرتين بمحلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي المعقم (PBS) بتركيز 1X. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي عند 250 جم لمدة 10 دقائق، ثم يُتخلص من السائل الطافي. 2. تعليق الخلايا في وسط زراعة الأنسجة الكامل (RPMI مُضاف إليه 1% بنسلين/ستربتومايسين، و1% إل-جلوتامين، و10% مصل جنيني بقري). يتم عد الخلايا وضبط تركيزها إلى 2-3 ملايين خلية/مل. 3. وضع ملصق على أنبوبين مخروطيين معقمين سعة 50 مل، أحدهما "غير مُحفز" والآخر "مُحفز بـ CpG". وزّع الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) في كل أنبوب (مليونان خلية/اختبار). 4. أضف 5 ميكروغرام من قليل النوكليوتيدات CpG (شركة كولي للأدوية، رقم المنتج 2336) لكل مل من الخلايا إلى أنبوب "المحفز بـ CpG". أغلق الأنبوب بإحكام ورجّه برفق. 5. حضّن كلا الأنبوبين لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. 6. خفّف محلول BD FastImmune™ Brefeldin A (BFA) (رقم المنتج 347688) بنسبة 1 إلى 10 في محلول فوسفات ملحي معقم (PBS) بتركيز 1X. 7. أضف 20 ميكرولتر من محلول BFA بتركيز 1X لكل مل إلى كلا الأنبوبين ("غير المحفز" و"المحفز بـ CpG"). حضّن الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ملاحظة: احتفظ بكل من CpG وBFA عند -20 درجة مئوية. ٨. أضف ١٠٠ ميكرولتر من محلول EDTA بتركيز ٢٠ ملي مولار (من شركة سيجما، رقم المنتج E7889) لكل مل من الخلايا إلى كلا الأنبوبين، ثم حضّنهما طوال الليل عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية. تلوين السطح والخلايا من الداخل: ٩. ضع الأنبوبين في جهاز الطرد المركزي عند قوة ٢٥٠ غرام لمدة ١٠ دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم أعد تعليق الخلايا في ٢٥ مل من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦). ١٠. ضع الأنبوبين في جهاز الطرد المركزي عند قوة ٢٥٠ غرام لمدة ١٠ دقائق. تخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS) بتركيز ٢٠ مليون خلية لكل مل. ١١. ضع علامات مناسبة على أنابيب البولي بروبيلين ١٢ × ٧٥ مم. أضف ١٠٠ ميكرولتر من الخلايا إلى كل أنبوب. ١٢. أضف الأجسام المضادة لتلوين سطح الخلايا إلى كل أنبوب: الجسم المضاد البشري Lin-1 FITC (رقم المنتج 340546)، والجسم المضاد البشري CD123 PerCPCy5.5 (رقم المنتج 558714/560904)، والجسم المضاد البشري HLA-DR APC (رقم المنتج 559868). حضّن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. ١٣. بعد التحضين، أضف 2 مل من محلول التلوين البارد (FBS) إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 250 غرام لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم رجّ الرواسب جيدًا لإعادة تعليق الخلايا. ١٤. أضف 1 مل من محلول BD Cytofix/Cytoperm بدرجة حرارة الغرفة (رقم المنتج 554722) إلى كل أنبوب. امزج جيدًا، ثم حضّن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. ١٥. أضف ٢ مل من محلول BD Perm/Wash™ البارد (رقم المنتج ٥٥٤٧٢٣) إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند ٥٠٠ غرام لمدة ٥ دقائق. تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم رجّ الرواسب جيدًا لإعادة تعليق الخلايا. كرر خطوة الغسل. ١٦. أضف الجسم المضاد الفلوري للتلوين داخل الخلايا، BD Horizon™ V450 Mouse Anti-Human IFN-α2b (IFN-alpha2b؛ رقم المنتج ٥٦١٣٨٢؛ ٥ ميكرولتر/اختبار)، أو عنصر التحكم المناعي الفلوري المناسب بالحجم المناسب لكل اختبار إلى الأنابيب، واخلط جيدًا بالرجّ. أكمل حجم الاختبار إلى ١٠٠ ميكرولتر باستخدام محلول BD Perm/Wash البارد. حضّن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ٦٠ دقيقة في الظلام. ١٧. أضف ٢ مل من محلول BD Perm/Wash البارد إلى كل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند ٥٠٠ غرام لمدة ٥ دقائق؛ تخلص من السائل الطافي بالشفط، ثم قم برجّ الراسب باستخدام جهاز الخلط الدوامي لإعادة تعليق الخلايا. ١٨. أضف ٥٠٠ ميكرولتر من محلول التلوين البارد إلى كل أنبوب لإجراء تحليل التدفق الخلوي الفوري. اختياري: أعد تعليق كريات الخلايا في ٢٠٠ ميكرولتر من محلول الفورمالدهيد البارد بنسبة ١٪، واحفظ الأنابيب عند ٤ درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى ٢٤ ساعة قبل إجراء تحليل التدفق الخلوي. في حال التخزين لأكثر من ٢٤ ساعة، نوصي بغسل الخلايا في محلول التلوين (FBS) لأن الحضانة المطولة مع المثبتات قد تؤثر على الفلوركرومات. تحليل التدفق الخلوي وتحليل البيانات: احصل على ما لا يقل عن ٥٠٠٠٠٠ حدث (خلايا ليمفاوية وخلايا وحيدة النواة). يتطلب تحليل البيانات بنجاح استخدام استراتيجية بوابات متسلسلة: 1. حدد الخلايا اللمفاوية والخلايا الوحيدة بدقة باستخدام بيانات تشتت الضوء الأمامي والجانبي. 2. اعرض بيانات Lin-1 مقابل HLA-DR للخلايا اللمفاوية والخلايا الوحيدة المحددة، واختر الخلايا السالبة لـ Lin-1 والموجبة لـ HLA-DR. تأكد من عدم تضمين أي خلايا موجبة لـ Lin-1. 3. اعرض بيانات IFN-alpha2b (IFN-alpha) مقابل CD123 للخلايا المحددة للكشف عن الخلايا الموجبة لـ IFN-alpha. تُستخدم عينة "غير محفزة" كعينة تحكم سلبية لتحديد مؤشرات قياس تردد الخلايا الموجبة لـ IFN-α2b (IFN-alpha). افتح البوابة الثانية للخلايا السالبة لـ Lin-1 والموجبة لـ HLA-DR، ثم افتح البوابة الثالثة للخلايا الموجبة لـ CD123 والموجبة لـ IFN-alpha. احصل على ما يقارب 150 إلى 200 حدث في ربع الخلايا الإيجابية المزدوجة CD123+ IFN-alpha+.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى مراجعة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. يتميز BD Horizon V450 بامتصاص أقصى عند 406 نانومتر وانبعاث أقصى عند 450 نانومتر. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. Pacific Blue™ هي علامة تجارية لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون.