BD، 561501، BD Horizon™ V500 Annexin V

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
RRID: AB_10694254
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA ومثبت البروتين و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بـ BD Horizon™ V500 في ظل الظروف المثلى، وتمت إزالة BD Horizon™ V500 غير المتفاعل.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ BD™ Horizon V500 Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط V500 Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين V500 Annexin V. يجب على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام V500 Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH 3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engelend et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام V500 Annexin V على خط خلوي (Jurkat). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 ملي مولار في DMSO. 2. خلايا Jurkat T (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10^6 خلية Jurkat. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتباع بروتوكول تلوين V500 Annexin V لقياس موت الخلايا المبرمج. بروتوكول تلوين V500 Annexin V: الكواشف: 1. V500 Annexin V: مُضمَّن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. ٢. ٧-أمينو-أكتينوميسين د (٧-AAD): غير مُضمّن. ٧-AAD (رقم المنتج ٥٥٩٩٢٥) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم ٥ ميكرولتر لكل اختبار. ٣. محلول ربط أنيكسين ١٠X: غير مُضمّن. ٠.١ مولار هيبس (الأس الهيدروجيني ٧.٤)، ١.٤ مولار كلوريد الصوديوم، ٢٥ ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة ٤ درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء محلول ربط أنيكسين V من BD Pharmingen™، بتركيز ١٠X (رقم المنتج ٥٥٦٤٥٤). التلوين: ١. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط ١X بتركيز ١ × ١٠^٦ خلية/مل. ٢. انقل ١٠٠ ميكرولتر من المحلول (١ × ١٠^٥ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة ٥ مل. ٣. أضف ٥ ميكرولتر من V500 Annexin V (لتحليل اللون الواحد واللونين) و٥ ميكرولتر من 7-AAD (لتحليل اللونين فقط). ٤. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة (٢٥ درجة مئوية) في الظلام. ٥. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول الربط ١× إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: ١. خلايا غير مصبوغة. ٢. خلايا مصبوغة بـ V500 Annexin V فقط (بدون 7-AAD). ٣. خلايا مصبوغة بـ 7-AAD فقط (بدون V500 Annexin V). ضوابط التلوين الأخرى: يُنصح باستخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام V500 Annexin V و/أو V500 Annexin V و7-AAD. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المُحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (V500 Annexin V إيجابي، 7-AAD سلبي أو V500 Annexin V إيجابي، 7-AAD إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المُعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا الميتة والمُستَميتة. ثم تُحدد نسبة الخلايا التي تم تحفيزها على الخضوع للاستماتة عن طريق طرح نسبة الخلايا المُستَميتة في المجموعة غير المُعالجة من نسبة الخلايا المُستَميتة في المجموعة المُعالجة. بما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية لعملية الاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة ستكون ذات غشاء تالف وستظهر تفاعلاً إيجابياً مع كل من 7-AAD وV500 Annexin V. وبالتالي، فإن هذا الفحص لا يميز بين الخلايا التي خضعت بالفعل للاستماتة وتلك التي ماتت نتيجة لمسار النخر، لأنه في كلتا الحالتين ستظهر الخلايا الميتة تفاعلاً إيجابياً مع كل من V500 Annexin V و7-AAD.
ملاحظات المنتج: تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية، وتقع في الولايات المتحدة. تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. يتميز كاشف BD Horizon V500 بامتصاص أقصى يبلغ 415 نانومتر وانبعاث أقصى يبلغ 500 نانومتر. قبل التلوين بهذا الكاشف، يرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يرجى الرجوع إلى صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. يرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.