BD، 562158، صبغة تكاثر البنفسجي BD Horizon™ 450

التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)
RRID: AB_2869398
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
إجراءات الفحص الموصى بها: المواد المتوفرة: • صبغة VPD450 (1 ملغ/قارورة، تُحفظ مجففة عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية) المواد المطلوبة غير المتوفرة: • معلقات خلايا مفردة حية من الخلايا اللمفاوية الأولية محل الاهتمام • ثنائي ميثيل سلفوكسيد طازج من درجة نقاء مناسبة لزراعة الخلايا (DMSO؛ على سبيل المثال Sigma D2650) • محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي المعقم (1× PBS) • وسط زراعة الخلايا، على سبيل المثال مع 10% من مصل الأبقار الجنيني (FBS) • أنابيب مخروطية معقمة من البولي بروبيلين سعة 15 مل (BD Falcon™ 352097) أو 50 مل (BD Falcon™ 352098) • أنابيب طرد مركزي دقيقة أو قوارير تجميد سعة 2 مل • أجسام مضادة فلورية للتحليل المناعي أو الوظيفي (اختياري) المعدات المطلوبة: • جهاز BD مزود بليزر بنفسجي جهاز قياس التدفق الخلوي FACSCanto™ II أو BD LSRFortessa™ أو BD™ LSR II • جهاز طرد مركزي • حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية وحمام مائي عند 37 درجة مئوية. الإجراء: يتميز VPD450 بامتصاص أقصى عند 410 نانومتر وانبعاث أقصى عند 450 نانومتر. قبل التلوين بهذا الكاشف، يرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. تحضير محلول صبغة VPD450 في DMSO: 1. تحضير محلول أساسي بتركيز 1 ملي مولار من صبغة VPD450: • أضف 1.0 مل من DMSO إلى قارورة VPD450. اخلط جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. • انقل الصبغة المذابة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل (أو أي أنبوب يتسع لحجم يصل إلى 3 مل). • أضف 1.63 مل من DMSO واخلط جيدًا مرة أخرى لضمان ذوبان الصبغة تمامًا. ٢. حضّر حصصًا للاستخدام لمرة واحدة من محلول VPD450 المركز (حجم يحدده المستخدم) باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة أو أنابيب تجميد سعة ٢ مل مُعَلَّمة بشكل مناسب (يجب أن يتضمن الملصق اسم الصبغة وتركيزها وتاريخ التحضير). ٣. جمّد جميع الحصص عند درجة حرارة -٨٠ درجة مئوية، مع حمايتها من الضوء. ملاحظة: يمكن تخزين محلول VPD450 المركز عند درجة حرارة -٨٠ درجة مئوية لمدة تصل إلى ٦ أشهر. يمكن إذابة الحصص وإعادة تجميدها حتى مرتين دون تقليل شدة الفلورة لعينات الخلايا الموسومة بـ VPD450 بشكل ملحوظ. وسم الخلايا بـ VPD450: تم تحسين هذا الإجراء لوسم الخلايا الليمفاوية للفئران والبشر بتركيزات خلوية تتراوح بين ١٠ و٣٠ × ١٠^٦ خلية/مل. في حال وسم عدد أقل من الخلايا، اتبع الخطوة ٦ أدناه (أي أضف ١ ميكرولتر من VPD450 لكل ١ مل من معلق الخلايا). ١. قم بإذابة محلول VPD450 المركز بتركيز 1 ملي مولار، إذا كان مجمداً مسبقاً. ٢. انقل معلقات الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين سعة 15 أو 50 مل. ملاحظة: تجنب استخدام أوعية بلاستيكية من البوليسترين لأن الصبغة ستلتصق بالبلاستيك. ٣. اغسل الخلايا في محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1× لإزالة أي بروتينات مصل متبقية. ٤. كرر الخطوة ٣. ٥. أعد تعليق الخلايا جيداً للحصول على معلق خلوي أحادي بتركيز 10-30 × 10^6 خلية/مل في محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 1×. ٦. أضف 1 ميكرولتر من محلول VPD450 المركز بتركيز 1 ملي مولار لكل 1 مل من معلق الخلايا، ليصل التركيز النهائي لـ VPD450 إلى 1 ميكرومولار. ٧. حضّن معلق الخلايا والصبغة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. ٨. أضف ٩ أضعاف الحجم الأصلي لمحلول الفوسفات الملحي (PBS) بتركيز ١× إلى الخلايا، ثم قم بترسيبها بالطرد المركزي. ٩. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا المترسبة. ١٠. أضف ١٠ مل من الوسط الكامل مع ١٠٪ من مصل بقري جنيني (FBS)، وكرر عملية الطرد المركزي. ١١. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا المترسبة. ١٢. أعد تعليق الخلايا في الوسط الكامل، ثم تابع زراعة الخلايا أو تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. ملاحظات: • تأكد من سطوع وسم الخلايا بمقارنة الخلايا الموسومة بخلايا التحكم غير الموسومة. • مباشرةً بعد الوسم باستخدام VPD450، قد تُظهر الخلايا تألقًا في قنوات أخرى، وخاصة القناة الخضراء (مثل BD Horizon™ V500، AmCyan)، عند إثارتها بواسطة الليزر البنفسجي. ومع ذلك، يعود هذا التألق إلى مستوياته الطبيعية بعد ٢٤ ساعة. يمكن استخدام صبغة VPD450 في فحوصات التلوين داخل الخلايا التي تتطلب التثبيت بالفورمالديهايد والنفاذية بالميثانول والمنظفات، مثل تلك المستخدمة في تلوين BD Phosflow™ أو تلوين السيتوكينات داخل الخلايا. ويمكن الحصول على شدة تلوين أولية أعلى بزيادة تركيز صبغة VPD450 الأولي. مع ذلك، وكما هو الحال مع أصباغ التتبع الأخرى التي تحتوي على إستر السكسينيميديل، قد تؤدي التركيزات العالية إلى زيادة سمية الخلايا أو موتها.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Cy هي علامة تجارية لشركة GE Healthcare. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.