BD، 562247، صبغة بي دي هورايزون™ القابلة للتثبيت 450

التطبيق: قياس التدفق الخلوي، التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869405
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
إجراءات التحليل الموصى بها: التحضير: ضع مسحوق صبغة FVS450 و400 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ مثل Sigma D2650) النقي المستخدم في زراعة الخلايا في درجة حرارة الغرفة. أضف 400 ميكرولتر من DMSO ورجّ المحلول جيدًا. افحص المحلول وكرر الرجّ حتى تذوب الصبغة تمامًا. التخزين: عند الاستلام، خزّن الصبغة الجافة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. بعد إذابتها في DMSO، خزّن المحلول عند -20 درجة مئوية. يمكن استخدام محلول الصبغة لمدة تصل إلى أربع دورات تجميد وإذابة. يمكن تحضير أجزاء صغيرة (مثلًا، أجزاء بحجم 100 ميكرولتر تقريبًا) وتخزينها عند -20 درجة مئوية عند الحاجة لإجراء تجارب أصغر. لا تستخدم الصبغة المُذابة بعد 40 يومًا من التخزين. يُرجى التخلص من محلول الصبغة بعد 40 يومًا من إذابتها في DMSO. متطلبات قياس التدفق الخلوي: يمكن استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي المزودة بليزر بنفسجي (مثل BD FACSCanto™ II أو BD LSRFortessa™ أو BD™ LSR II). يُفضل استخدام مجموعة جزيئات التعويض BD™ CompBeads المضادة للفأر Ig، κ/التحكم السلبي (FBS) (رقم المنتج 552843) المصبوغة بأجسام مضادة BD Horizon™ V450 للفأر المضادة لـ CD3 أو CD4 أو CD19 البشري. كبديل، يمكن استخدام مجموعة جزيئات التعويض BD™ CompBeads المضادة للجرذ Ig، κ/التحكم السلبي (FBS) (رقم المنتج 552844) المصبوغة بأجسام مضادة BD Horizon™ V450 للجرذ المضادة للفأر CD3 أو CD4 أو CD19. إجراء وسم الخلايا باستخدام صبغة Fixable Viability Stain 450: 1. تحضير الخلايا لتلوينها بتقنية قياس التدفق الخلوي باستخدام محاليل خالية من أزيد الصوديوم. 2. غسل الخلايا مرة واحدة في محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي (DPBS) الخالي من أزيد الصوديوم والبروتين. 3. إعادة تعليق الخلايا بتركيز يتراوح بين 1 و10 × 10^6 خلية/مل في محلول DPBS 1X الخالي من أزيد الصوديوم والبروتين. 4. إضافة 1 ميكرولتر من محلول Fixable Viability Stain 450 المركز لكل 1 مل من معلق الخلايا، ثم خلطها فورًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. 5. حضانة المزيج لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الضوء. اختياري: حضانة الخلايا ومخاليط الصبغة عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة (قد يكون ذلك أفضل في تطبيقات خلايا الفئران). أو بدلاً من ذلك، حضانة المخاليط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق (على سبيل المثال، لتطبيقات BD Phosflow™). ٦. اغسل الخلايا مرة أو مرتين باستخدام ٢ مل من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦) أو ما يعادله. ٧. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا المترسبة. ٨. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS) أو ما يعادله. ٩. صبغ الخلايا وثبتها واجعلها نفاذة حسب الحاجة للتطبيقات اللاحقة. ملاحظات: • يتم تثبيط تفاعل الصبغة الحرة بالغسل بمحلول يحتوي على بروتين (مثل FBS أو BSA) قبل التلوين بالأجسام المضادة الفلورية. • يمكن استخدام صبغة Viability Stain 450 القابلة للتثبيت في فحوصات التلوين داخل الخلايا التي تتطلب التثبيت بالفورمالديهايد والنفاذية بالميثانول والمنظفات، مثل تلك المستخدمة في تلوين BD Phosflow™ (مثلاً، رقم المنتج 558050، محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III) أو تلوين السيتوكينات داخل الخلايا (مثلاً، رقم المنتج 554714، مجموعة BD Cytofix/Cytoperm™ للتثبيت/النفاذية). • يمكن تلوين الخلايا بكميات كبيرة قبل التجميد أو التلوين بالأجسام المضادة الفلورية. يجب على كل مستخدم تحديد التركيزات المثلى للكواشف والخلايا والظروف المناسبة للفحص المطلوب.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. يتميز كاشف BD Horizon V450 بامتصاص أقصى عند 406 نانومتر وانبعاث أقصى عند 450 نانومتر. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. Cy علامة تجارية لشركة GE Healthcare. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.