BD، 564061، BD Pharmingen™ Calcein AM

التطبيق: التصوير الحيوي، قياس التدفق الخلوي (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869545
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
إجراءات التحليل الموصى بها: التحضير: ضع مسحوق BD Pharmingen™ Calcein AM وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) طازج من الدرجة المستخدمة في زراعة الخلايا (مثل Sigma، رقم المنتج D2650) في درجة حرارة الغرفة. أضف 201 ميكرولتر من DMSO لتحضير محلول أساسي بتركيز 5 ملي مولار (الكتلة المولية = 994.86 غ/مول) ورجّ المحلول جيدًا. افحص المحلول وكرر الرجّ حتى يذوب الصبغ تمامًا. التخزين: خزّن BD Pharmingen™ Calcein AM مجففًا عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. بعد إعادة تكوينه باستخدام DMSO، خزّن المحلول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في أجزاء صغيرة. تجنب دورات التجميد والذوبان. تخلص من أجزاء الصبغ بعد 6 أشهر من إعادة تكوينه باستخدام DMSO. ملاحظات • عند تخفيف صبغة BD Pharmingen™ Calcein AM بمحلول مائي، يجب استخدامها فورًا بعد التخفيف، حيث قد تتحلل هذه الصبغة القابلة للتحلل بواسطة الإستيراز تلقائيًا مع التعرض المطول للماء. • يرجى ملاحظة أن هذه الصبغات قابلة للتحلل بواسطة الإستيراز. قد يحتوي المصل على نشاط إستيراز، وقد تقلل المحاليل المنظمة المحتوية على المصل من دقة تمييز الخلايا الحية وغير الحية إذا استُخدمت أثناء التلوين. يمكن استخدام المحاليل المنظمة المحتوية على المصل في خطوات الغسل بعد اكتمال التلوين. • خصائص تداخل هذه الصبغة مشابهة لصبغة FITC. لذلك، نوصي بتعويض مناسب للألوان الأخرى التي يُثيرها الليزر الأزرق، مثل PE أو PerCP-Cy™5.5. بالإضافة إلى ذلك، نوصي باستخدام خلايا مُلوّنة بصبغة BD Pharmingen™ Calcein AM للتعويض. • هذه الصبغة غير قابلة للتثبيت. الإجراء العام: 1. تحضير الخلايا لتلوينها بتقنية قياس التدفق الخلوي باستخدام محلول منظم خالٍ من المصل (مثل محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي بتركيز 1X). 2. غسل الخلايا مرة واحدة في محلول منظم خالٍ من المصل. 3. إعادة تعليق الخلايا بتركيز يتراوح بين 1 و10 × 10^6 خلية/مل في صبغة مخففة في محلول منظم خالٍ من المصل. أ. نوصي بالتلوين بتركيز نهائي يتراوح بين 1 و10 ميكرومتر من صبغة BD Pharmingen™ Calcein AM للتمييز بين الخلايا الحية والميتة، أو بتركيز يتراوح بين 0.1 و1 ميكرومتر للتطبيقات متعددة الألوان كنقطة بداية. نظرًا لأن شدة الفلورة قد تختلف باختلاف نوع الخلية والظروف التجريبية، يُوصى بإجراء معايرة لتحديد تركيز الصبغة الأمثل لكل بروتوكول تجريبي. 4. حضانة المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الضوء. 5. غسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل من محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) أو ما يعادله. ٦. اسحب السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك كتلة الخلايا. ٧. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS) أو ما يعادله. ٨. حلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي أو لونها حسب الرغبة للتطبيقات اللاحقة. ملاحظات حول الخلايا الملتصقة: يمكن تلوين الخلايا الملتصقة وهي معلقة أو في مكانها. لتلوين الخلايا الملتصقة وهي معلقة، اتبع "الإجراء العام" الموضح أعلاه بعد فصل الخلايا إلى معلق خلوي أحادي. لاحظ أنه بالنسبة لبعض الخلايا، قد يؤثر الإزالة الأنزيمية من وسط النمو على سلامة غشاء الخلية، مما قد يؤثر على التلوين باستخدام BD Pharmingen™ Calcein AM. يوصى بترك الخلايا تتعافى من التفكك الأنزيمي في وسط النمو. قد يختلف وقت التعافي باختلاف سلالة الخلية، لذلك قد يكون من المفيد اختبار فترات تعافي متعددة في التجارب الأولية. للتلوين في مكانه، نوصي بالبروتوكول التالي: ١. أزل الوسط واغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول خالٍ من المصل لإزالة أي وسط متبقٍ. ٢. أضف الصبغة المخففة في محلول منظم خالٍ من المصل إلى المزرعة. أ. نوصي بالتلوين بتركيز ١-١٠ ميكرومتر من صبغة BD Pharmingen™ Calcein AM للتمييز بين الخلايا الحية والميتة، أو بتركيز ٠.١-١ ميكرومتر للتطبيقات متعددة الألوان. نظرًا لأن درجة السطوع قد تختلف باختلاف نوع الخلية والظروف التجريبية، يُوصى بإجراء معايرة لتحديد تركيز الصبغة الأمثل لكل بروتوكول تجريبي. ٣. حضّن المزيج لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية مع حمايته من الضوء. ٤. اغسل المزارع مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) أو ما يعادله. ٥. أزل الخلايا من وسط النمو. نوصي باستخدام محلول فصل الخلايا BD™ Accutase™. أ. اغسل الخلايا مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) أو ما يعادله. ب. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS) أو ما يعادله. ج. قم بتحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي أو قم بتلوينها حسب الرغبة للتطبيقات اللاحقة.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Accutase هي علامة تجارية مسجلة لشركة Innovative Cell Technologies, Inc. جميع العلامات التجارية الأخرى هي علامات تجارية مملوكة لأصحابها. Cy هي علامة تجارية لشركة GE Healthcare. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.