BD، 564405، صبغة بي دي هورايزون™ القابلة للتثبيت 660

التطبيق: قياس التدفق الخلوي، التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869571
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
إجراءات التحليل الموصى بها: التحضير: ضع مسحوق صبغة FVS660 و190 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ على سبيل المثال، Sigma D2650) الطازج المستخدم في زراعة الخلايا في درجة حرارة الغرفة. أضف 190 ميكرولتر من DMSO ورج المحلول جيدًا. افحص المحلول وكرر الرج حتى تذوب الصبغة تمامًا. هذا هو المحلول الأصلي. التخزين: عند الاستلام، خزّن الصبغة الجافة في مكان جاف بعيدًا عن الضوء عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. بعد إذابتها في DMSO، خزّن المحلول الأصلي في درجة حرارة -20 درجة مئوية في أجزاء صغيرة. لا تستخدم الصبغة المُذابة بعد 90 يومًا من التخزين. يُرجى التخلص من محلول الصبغة بعد 90 يومًا من إذابتها في DMSO. متطلبات قياس التدفق الخلوي: يمكن استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي المزودة بليزر أحمر (مثل BD FACSCanto™ II، أو BD LSRFortessa™، أو BD™ LSR II، أو BD Accuri™ C6). يمكن قراءة هذا الصبغ من المرشحات الشائعة الاستخدام لصبغة APC أو Alexa Fluor® 647 (مثل 660/20 أو 670/30). يُفضل استخدام عينة من الخلايا المراد قياسها لتحقيق أفضل تعويض للفلورة. الإجراء: وسم الخلايا بصبغة حيوية قابلة للتثبيت 660: 1. تحضير الخلايا للتلوين باستخدام قياس التدفق الخلوي باستخدام محاليل خالية من أزيد الصوديوم. 2. غسل الخلايا مرة واحدة في محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي (DPBS) الخالي من أزيد الصوديوم والبروتين (1X). 3. إعادة تعليق الخلايا بتركيز 1-10 × 10^6 خلية/مل في محلول DPBS الخالي من أزيد الصوديوم والبروتين (1X). ٤. أضف ١ ميكرولتر من محلول BD Horizon™ Fixable Viability Stain 660 Stock Solution لكل ١ مل من معلق الخلايا (١:١٠٠٠) وقم بالخلط فورًا. ملاحظة: نوصي بمعايرة الصبغة للحصول على أفضل النتائج، حيث أن أنواع الخلايا المختلفة والتطبيقات المختلفة قد تؤدي إلى تباين كبير في التلوين. يرجى قراءة الملاحظة ١ أدناه للاطلاع على النطاقات الموصى بها. ٥. حضّن الخليط لمدة ١٠-١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو ٢-٨ درجة مئوية بعيدًا عن الضوء. اختياري: بدلاً من ذلك، حضّن الخليط عند ٣٧ درجة مئوية لمدة ٥-٧ دقائق. ٦. اغسل الخلايا مرتين باستخدام ٢ مل من محلول BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦) أو ما يعادله. ٧. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا المترسبة. ٨. أعد تعليق الخلايا في محلول Stain Buffer (FBS) أو ما يعادله. ٩. قم بتلوين الخلايا وتثبيتها وتسهيل نفاذيتها حسب الحاجة للتطبيقات اللاحقة. ملاحظات: ١. يجب على كل مستخدم تحديد التركيزات المثلى للكواشف والخلايا والظروف المناسبة للتحليل المطلوب. نوصي بمعايرة الكاشف في التجارب الأولية للحصول على أفضل النتائج. فيما يلي نطاقات وجدناها مناسبة لأنظمة خلوية مختلفة: أ. الدم الكامل المحلل: ١:١٠٠٠ من المحلول الأصلي. ب. الخلايا الأولية: ١:١٠٠٠ - ١:٤٠٠٠ من المحلول الأصلي. ج. خطوط الخلايا: ١:٤٠٠٠ - ١:١٠٠٠٠ من المحلول الأصلي. ٢. يتم تثبيط تفاعل الصبغة الحرة بالغسل بمحلول منظم يحتوي على بروتين (مثل مصل جنين البقر أو ألبومين مصل البقر). ٣. يمكن تلوين الخلايا بكميات كبيرة قبل التجميد أو التلوين بالأجسام المضادة الفلورية. ٤. يمكن استخدام صبغة BD Horizon™ Fixable Viability Stain 660 في فحوصات التلوين داخل الخلايا التي تتطلب التثبيت بالفورمالديهايد والنفاذية بالميثانول والمنظفات، مثل تلك المستخدمة في تلوين BD Phosflow™ (مثلاً، رقم المنتج 558050، محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III)، أو تلوين السيتوكينات داخل الخلايا (مثلاً، رقم المنتج 554714، مجموعة BD Cytofix/Cytoperm™ للتثبيت/النفاذية)، أو تلوين عوامل النسخ (مثلاً، رقم المنتج 562574/562725، مجموعة BD Pharmingen™ Transcription Factor Buffer Set). ٥. قد تُظهر الخلايا الميتة تباينًا في التلوين. نوصي بالتلوين المشترك، على سبيل المثال، باستخدام Annexin V FITC (رقم المنتج 556419) إذا رغبنا في إجراء تحليل إضافي للخلايا الميتة.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Alexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.