BD، 564697، BD Pharmingen™ MitoStatus Red

التطبيقات: التصوير الحيوي، قياس التدفق الخلوي، التألق المناعي (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869607
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
إجراءات التحليل الموصى بها: التحضير: ضع قارورة واحدة (50 ميكروغرام) من مسحوق صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) طازج من الدرجة المستخدمة في زراعة الخلايا (مثل Sigma D2650) في درجة حرارة الغرفة. لإعادة تكوين مسحوق صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red في DMSO بتركيز أساسي 0.2 ملي مولار، أضف 460 ميكرولتر من DMSO إلى قارورة واحدة من مسحوق الصبغة. التخزين: عند الاستلام، خزّن مسحوق الصبغة مجففًا ومحميًا من الضوء عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. يبقى مسحوق الصبغة مستقرًا لمدة 12 شهرًا على الأقل عند تخزينه وفقًا للإرشادات. بعد إعادة التكوين باستخدام DMSO، خزّن المحلول الأساسي عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية في أجزاء صغيرة. يبقى المحلول الأساسي مستقرًا لمدة 6 أشهر على الأقل عند تخزينه وفقًا للإرشادات. متطلبات قياس التدفق الخلوي: قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يمكن استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي (مثل BD FACSCanto™ II، وBD LSRFortessa™، وBD™ LSR II، أو BD Accuri™ C6) المزودة بليزر أحمر (مثل 633 نانومتر). يمكن قراءة هذه الصبغة باستخدام المرشحات الشائعة الاستخدام لـ APC أو Alexa Fluor® 647 (مثل 660/20 أو 670/30). يُفضل استخدام عينة من الخلايا المراد فحصها لتحقيق أفضل تعويض للفلورة. عند تصميم لوحات التلوين الفلوري متعددة الألوان، يُرجى الانتباه إلى احتمالية التداخل العالي في كواشف الفلوركرومات التالية: Alexa Fluor® 700، وAPC-H7، وPerCP-Cy™5.5، وBV711، وBV786. نوصي بمعايرة الصبغة واستخدام أقل تركيز ممكن يوفر دقة كافية لفصل الخلايا المستقطبة وغير المستقطبة لنوع الخلية المراد دراستها، وذلك للحد من التداخل اللوني. إجراء وسم الخلايا المعلقة بصبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red لتحليل التدفق الخلوي: 1. عدّ الخلايا لتحديد كثافتها. اضبط كثافة الخلايا إلى 1 × 10^6 خلية/مل أو أقل في وسط زراعة خلايا طازج مُدفأ مسبقًا. 2. لوّن الخلايا في وسط زراعة خلايا طازج مُدفأ مسبقًا أو محلول التلوين المطلوب باستخدام 20-200 نانومتر من صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red في وعاء من البولي بروبيلين، وذلك بإضافة المحلول المركز مباشرةً إلى الخلايا بالتركيز المطلوب. ملاحظة: يمكن أيضًا إضافة صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red مباشرةً إلى المزرعة بدلًا من التلوين في وسط طازج. يمكن أيضًا إجراء التلوين باستخدام محلول التلوين BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) المُسخّن مسبقًا (رقم المنتج 554656) أو محلول Dulbecco's PBS المُسخّن مسبقًا. قد يُحسّن محلول Dulbecco's PBS دقة بعض أنواع الخلايا، ولكنه قد يؤدي أيضًا إلى زيادة التلوين الخلفي. ب. ملاحظة: للمساعدة في تحديد البوابات في قياس التدفق الخلوي، نوصي باستخدام خلايا تحكم مُعالجة بالمذيب فقط و/أو مُفكِّك اقتران الميتوكوندريا، مثل FCCP [كربونيل سيانيد 4 (تريفلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون، على سبيل المثال، Sigma رقم المنتج C2920]. 3. حضّن العينات لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع حمايتها من الضوء. 4. اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول التلوين BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (رقم المنتج 554656). 5. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك راسب الخلايا. ٦. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS). ٧. حلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. بدلاً من ذلك، قم بتلوين الخلايا بشكل معاكس باستخدام أصباغ فلورية أو أجسام مضادة متوافقة حسب الرغبة، ثم قم بتحليلها. وسم الخلايا الملتصقة باستخدام صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red لقياس التدفق الخلوي: ١. يجب تلوين الخلايا الملتصقة في مكانها عند وصولها إلى كثافة ٧٠٪ أو أقل. قم بتلوين الخلايا في وسط زراعة خلايا طازج مُسخن مسبقًا أو في محلول التلوين المطلوب باستخدام ٢٠-٢٠٠ نانومتر من صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red عن طريق إضافة المحلول المركز مباشرةً إلى الخلايا بالتركيز المطلوب. أ. ملاحظة: يمكن أيضًا إضافة صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red مباشرةً إلى المزرعة بدلاً من التلوين في وسط طازج. يمكن أيضًا إجراء التلوين في محلول التلوين BD Pharmingen™ المُسخن مسبقًا (FBS) أو محلول DPBS المُسخن مسبقًا. قد يوفر محلول DPBS دقة أعلى لبعض أنواع الخلايا، ولكنه قد يؤدي أيضًا إلى زيادة التلوين الخلفي. ب. ملاحظة: لتسهيل عملية تحديد الخلايا في قياس التدفق الخلوي، نوصي باستخدام خلايا تحكم مُعالجة بالمذيب فقط و/أو مُفكِّك اقتران الميتوكوندريا، مثل FCCP. ٢. حضّن العينات لمدة ١٥-٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية في مكان مُظلم. ٣. اغسل الخلايا مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). ٤. أزل الخلايا من وسط النمو. نوصي باستخدام محلول فصل الخلايا BD™ Accutase™ (رقم المنتج ٥٦١٥٢٧). ٥. اغسل الخلايا مرتين بمحلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). ٦. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا. ٧. أعد تعليق الخلايا في محلول التلوين (FBS) أو ما يُعادله. ٨. حلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. بدلاً من ذلك، قم بتلوين الخلايا بأصباغ فلورية أو أجسام مضادة مُتوافقة حسب الرغبة ثم حللها. ملاحظات: ١. هذا الصبغ غير مُتوافق مع التثبيت. ٢. يجب على كل مستخدم تحديد التركيزات المثلى للكواشف والخلايا والظروف اللازمة للتحليل المطلوب. نوصي بمعايرة الكاشف في التجارب الأولية للحصول على أفضل النتائج. ٣. يمكن تلوين الخلايا بكميات كبيرة قبل تلوينها بالأجسام المضادة الفلورية. وسم الخلايا باستخدام صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red للتصوير الفلوري: ١. تلوين الخلايا في وسط جديد مُسخن مسبقًا بتركيز ٢٠-٢٠٠ نانومتر من صبغة BD Pharmingen™ MitoStatus Red. ٢. حضانة العينات لمدة ١٥-٣٠ دقيقة عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية مع حمايتها من الضوء. ٣. إزالة محلول التلوين واستبداله بمحلول فوسفات ملحي مُسخن مسبقًا. ٤. تحليل الخلايا باستخدام التصوير الفلوري. بدلاً من ذلك، يمكن تلوين الخلايا بشكل معاكس باستخدام أصباغ أو أجسام مضادة فلورية متوافقة حسب الرغبة، ثم تحليلها.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. Accutase علامة تجارية مسجلة لشركة Innovative Cell Technologies, Inc.، وAlexa Fluor® علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes, Inc.، يوجين، أوريغون. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Cy علامة تجارية لشركة GE Healthcare. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.