BD، 565082، BD Horizon™ CFSE

التطبيق: التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (يتم اختباره بشكل روتيني)
RRID: AB_2869649
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، مع حمايته من التعرض للضوء.
إجراءات الفحص الموصى بها: إجراءات الفحص الموصى بها المواد المتوفرة صبغة CFSE (قارورتان، 500 ميكروغرام من الصبغة لكل قارورة) المواد المطلوبة ولكن غير متوفرة • معلقات خلايا مفردة قابلة للحياة من الخلايا اللمفاوية الأولية ذات الأهمية • ثنائي ميثيل سلفوكسيد طازج من درجة زراعة الخلايا (DMSO؛ على سبيل المثال، Sigma D2650) • محلول ملحي فوسفاتي معقم من دولبيكو (1× DPBS) • وسط زراعة الخلايا، على سبيل المثال، مع 10% من مصل الأبقار الجنيني (FBS) • أنابيب مخروطية معقمة من البولي بروبيلين سعة 15 مل أو 50 مل • أنابيب طرد مركزي دقيقة أو أنابيب تجميد سعة 2 مل • أجسام مضادة فلورية للتحليل المناعي أو الوظيفي (اختياري) المعدات المطلوبة • مقياس تدفق مزود بليزر أزرق؛ مثال: جهاز قياس التدفق الخلوي BD FACSCanto™ II، أو BD LSRFortessa™، أو BD LSR™ II، أو BD Accuri™ C6 • جهاز طرد مركزي • حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية وحمام مائي عند 37 درجة مئوية. التخزين: عند الاستلام، يُحفظ مسحوق الصبغة مع مادة مجففة ويُحفظ بعيدًا عن الضوء عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. بعد إذابته في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، يُحفظ المحلول المركز مع مادة مجففة عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية في أجزاء صغيرة. يبقى المحلول المركز ثابتًا لمدة 3 أشهر عند تخزينه وفقًا للإرشادات. الإجراء: يتميز CFSE بامتصاص أقصى عند 490 نانومتر وانبعاث أقصى عند 520 نانومتر. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة المنبعثة. تحضير محلول صبغة CFSE في DMSO: 1. حضّر محلولًا أساسيًا من صبغة CFSE بتركيز 10 ملي مولار بإضافة 90 ميكرولتر من DMSO إلى قارورة واحدة من CFSE. امزج جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. 2. حضّر حصصًا للاستخدام لمرة واحدة من محلول CFSE الأساسي (حجم يحدده المستخدم) باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة مُعَلَّمة بشكل مناسب أو أنابيب تجميد سعة 2 مل. 3. جمّد جميع الحصص عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية مع مادة مجففة واحفظها بعيدًا عن الضوء. وسم الخلايا بصبغة CFSE: تم تحسين هذه الطريقة لوسم الخلايا الليمفاوية للفئران والبشر بتركيزات خلوية تتراوح بين 10 و30 × 10^6 خلية/مل. قد يلزم تحسين ظروف الفحص لأنواع الخلايا الأخرى أو كثافات الخلايا الأخرى. 1. قم بإذابة محلول CFSE الأساسي بتركيز 10 ملي مولار، إذا كان مُجمدًا مسبقًا. 2. انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين سعة 15 أو 50 مل. 3. اغسل الخلايا بمحلول DPBS بتركيز 1× لإزالة أي بروتينات مصل متبقية. 4. كرر الخطوة 3. 5. أعد تعليق الخلايا جيدًا في معلق خلوي أحادي بتركيز 10-30 × 10^6 خلية/مل في محلول DPBS بتركيز 1×. ملاحظة: تجنب التلوين في محاليل تحتوي على أزيد الصوديوم أو المصل أو البروتين، لأن هذه المواد ترتبط بالصبغة الحرة وقد تتداخل مع تلوين الخلايا. 6. أضف محلول CFSE المركز إلى المعلق الخلوي الأحادي للوصول إلى تركيز نهائي يتراوح بين 1 و10 ميكرومولار. إذا لزم الأمر، يمكن تخفيف المحلول المركز باستخدام DMSO قبل إضافته إلى المعلق الخلوي الأحادي. رجّ المعلق فورًا. 7. حضّن معلق الخلايا المصبوغة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. 8. أضف 9 أضعاف الحجم الأصلي من محلول DPBS بتركيز 1× إلى الخلايا، ثم افصل الخلايا بالطرد المركزي. ٩. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا المترسبة. ١٠. أضف ١٠ مل من الوسط الكامل مع ١٠٪ من مصل بقري جنيني، وكرر عملية الطرد المركزي. ١١. تخلص من السائل الطافي واخلط برفق لتفكيك الخلايا المترسبة. ١٢. أعد تعليق الخلايا في الوسط الكامل، ثم تابع زراعة الخلايا أو تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. ملاحظات: ١. تأكد من سطوع وسم الخلايا بمقارنة الخلايا الموسومة بخلايا التحكم غير الموسومة. ٢. يمكن استخدام صبغة BD Horizon™ CFSE في فحوصات التلوين داخل الخلايا التي تتطلب التثبيت بالفورمالديهايد والنفاذية بالميثانول والمنظفات، مثل تلك المستخدمة في تلوين BD Phosflow™ (مثلاً، رقم المنتج ٥٥٨٠٥٠، محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III)، أو تلوين السيتوكينات داخل الخلايا (مثلاً، رقم المنتج ٥٥٤٧١٤، مجموعة BD Cytofix/Cytoperm™ للتثبيت/النفاذية)، أو تلوين عوامل النسخ (مثلاً، رقم المنتج ٥٦٢٥٧٤/٥٦٢٧٢٥، مجموعة BD Pharmingen™ Transcription Factor Buffer). ٣. يمكن الحصول على شدة تلوين أولية أعلى بزيادة تركيز تحميل صبغة CFSE الأولي. مع ذلك، وكما هو الحال مع أصباغ التتبع الأخرى التي تحتوي على إستر السكسينيميديل، قد تؤدي التركيزات العالية إلى زيادة سمية الخلايا أو موتها.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. Cy هي علامة تجارية لشركة GE Healthcare. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.