BD، 565519، مسبار كاسبيز الخلايا الحية الأزرق من BD Pharmingen™

التطبيق: قياس التدفق الخلوي، التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869680
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، مع حمايته من التعرض للضوء.
إجراءات التحليل الموصى بها: ملاحظة: قبل التلوين، تأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. التحضير: اترك المسبار المجفف بالتجميد و50 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ مثل Sigma D2650) الطازج المستخدم في زراعة الخلايا حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 50 ميكرولتر من DMSO ورج المحلول جيدًا. افحص المحلول وكرر الرج حتى يذوب الصبغ تمامًا. هذا هو المحلول الأصلي. التخزين: عند الاستلام، خزّن المسبار الجاف في مكان جاف بعيدًا عن الضوء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. بعد إذابة المسبار في DMSO، خزّن المحلول الأصلي في درجة حرارة -20 درجة مئوية في أجزاء صغيرة. يبقى المحلول الأصلي صالحًا لمدة 3 أشهر على الأقل بعد إذابته في DMSO. متطلبات قياس التدفق الخلوي: يمكن استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي المزودة بليزر أزرق (مثل BD FACSCanto™ II، وBD LSRFortessa™، وBD™ LSR II، وBD Accuri™ C6). يمكن قراءة هذا الصبغ من المرشحات الشائعة الاستخدام لـ FITC (مثل 530/30 نانومتر). يُفضل استخدام عينة من الخلايا المستهدفة مصبوغة بالصبغ لتحقيق أفضل تعويض للفلورة. عند تصميم لوحات متعددة الألوان، نوصي بمعايرة الصبغ واستخدام أقل تركيز ممكن يوفر دقة كافية للتمييز بين الخلايا الموجبة والسالبة لنوع الخلية المستهدفة، وذلك للحد من التداخل. الإجراء: وسم الخلايا باستخدام مسبار BD Pharmingen™ Blue Live Cell Caspase Probe: 1. عد الخلايا لتحديد كثافتها. اضبط كثافة الخلايا إلى 1-2 × 10^6 خلية/مل في وسط زراعة خلايا طازج مُسخن مسبقًا. أ. يمكن صبغ الخلايا الملتصقة إما في مكانها أو في معلق خلوي بعد إزالتها من وسط النمو. يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70% أو أقل عند إجراء التحليل. ب. ملاحظة: يُعرَّف "الاختبار" الواحد بأنه عينة من الخلايا بحجم 500 ميكرولتر بتركيز 1-2 × 10^6 خلية/مل. 2. أضف 2 ميكرولتر من المحلول المركز لكل 1 مل من معلق الخلايا أو وسط الاستنبات. على سبيل المثال، لعينة من الخلايا بحجم 500 ميكرولتر، أضف 1 ميكرولتر من المحلول المركز. اخلط جيدًا. أ. في بعض الحالات، قد يكون من المفيد معايرة المجس، حيث يمكن أن تؤدي أنواع الخلايا المختلفة والتطبيقات المختلفة إلى تباين في شدة التلوين. 3. حضّن العينات لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع حمايتها من الضوء. 4. اغسل الخلايا مرة واحدة بوسط استنبات طازج مُدفأ مسبقًا. 5. أعد تعليق الخلايا في وسط جديد مُدفأ مسبقًا، واحضنها لمدة 15-60 دقيقة إضافية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في مكان مظلم للسماح للمسبار غير المرتبط بالانتشار خارج الخلايا. 6. افصل الخلايا مرة أخرى بالطرد المركزي، وتخلص من السائل الطافي. 7. أعد تعليق الخلايا في محلول دولبيكو الملحي المُخفف بالفوسفات (DPBS) بتركيز 1× أو ما يعادله. أ. ملاحظة: ترتبط الخلايا الميتة بكميات متفاوتة من المسبار. نوصي بالتلوين المشترك باستخدام مسبار فلوري إضافي، مثل محلول BD Via-Probe™ Cell Viability Solution (رقم المنتج 555816)، لتمييز الخلايا الميتة عن الخلايا الحية أو الخلايا التي تخضع للاستماتة. 8. حلل العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي. ملاحظات: 1. يجب على كل مستخدم تحديد التركيزات المثلى للكواشف والخلايا والظروف المناسبة للتحليل المطلوب. نوصي بمعايرة الكاشف في التجارب الأولية للحصول على أفضل النتائج. ٢. يتوافق مسبار كاسبيز الخلايا الحية الأزرق من BD Pharmingen™ مع بروتوكولات التثبيت والنفاذية، مثل تلك المستخدمة في تلوين BD Phosflow™ (على سبيل المثال، رقم المنتج ٥٥٨٠٥٠، محلول BD Phosflow™ Perm Buffer III) أو تلوين السيتوكينات داخل الخلايا (على سبيل المثال، رقم المنتج ٥٥٤٧١٤، مجموعة محلول التثبيت/النفاذية BD Cytofix/Cytoperm™). مع ذلك، يُرجى ملاحظة أن دقة التمييز بين الخلايا الموجبة والسالبة تقل في الخلايا المثبتة والمنفذة مقارنةً بالخلايا الحية. يُنصح، كلما أمكن، بتحليل العينات وهي حية.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى زيارة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. قبل التلوين بهذا الكاشف، يُرجى التأكد من قدرة جهاز قياس التدفق الخلوي على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة. للاطلاع على البروتوكولات الفنية، يُرجى زيارة www.bdbiosciences.com/us/s/resources.